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-------病毒灭活验证报告文件编号：编制：审核：批准：日期：目录1、目的：确认病毒灭活参数的有效性。2、范围：------原料。3、验证依据：《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》4、验证项目：在工艺过程中病毒滴定验证结果：病毒检验5、验证结论：病毒灭活参数有效。1.目的：所有用于医疗器械生产的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，为验证“-------”的生物原材料----种猪细小病毒、伪狂犬病毒病毒的感染情况，特进行下述实验。验证确保生物原材料的安全性。验证依据：《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》2、范围：适用于本公司------产品。3.职责：3.1技术部负责对病毒灭活验证的组织与实施。3.2检测中心负责产品的验收及计量、检验器具的检定。3.3生产部负责协助验证工作的实施。3.4质量部负责验证档案的存档。3.5验证小组成员：3.5.1人员姓名部门职责管理者代表批准方案、批准报告；技术部长负责制定验证方案和形成报告；生产部长负责试验样品的准备；质量部长负责计量器具的确认；负责对产品性能进行评价，并提供检测报告；3.5.2时间安排2014年9月10日开始4．程序：4.1“------”生物原材料-----的病毒污染验证文献综述根据现有的研究结果，猪的病毒包括猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪瘟、圆环病毒、口蹄疫、水泡、乙脑等病毒，其中猪细小病毒、伪狂犬病毒可感染人类。以下按猪源性病毒的来源、种类及分布；理化特性；检测方法的次序对各病分述如下：附表1猪源性病毒的特征病毒名称病毒的分类核酸类型囊膜病毒颗粒大小（nm）猪细小病毒B19DNA无20伪狂犬病毒HBVDNA有45附表2猪源性病毒的理化性质病毒名称温度耐受性化学物质敏感性猪细小病毒可耐70℃能抵抗脂溶剂、酸、甲醛蒸汽和紫外线，对漂白粉或氢氧化钠敏感，具有良好的血凝活性。伪狂犬病毒在37℃下的半衰期为7h，8℃可存活46天，而在25℃干草、树枝、食物上可存活10～30天。病毒在pH4～9之间保持稳定。5％石炭酸经2min灭活，但0.5％石炭酸处理32天后仍具有感染性。对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。附表3猪源性病毒的检测方法病毒名称血清抗体检测方法病毒抗原检测组织样品方法猪细小病毒血凝抑制新鲜脏器间接免疫荧光技术伪狂犬病毒中和试验患病动物的病料如脑或扁桃体的压片或冰冻切片直接免疫荧光技术参考文献1、《猪细小病毒病及其防制》—丁壮畜禽流行病防治丛书金盾出版社2、冼琼珍;黄良宗;彭启明;王淑敏;顾万军;;猪伪狂犬病毒和猪细小病毒二联PCR诊断方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（上）[C];2003年3、周泰冲;;猪伪狂犬病毒对人的感染性问题(综述)[J];兽医药品通讯;1986年03期4.2试验材料试验指示病毒为水疱性口炎病毒、伪狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒和猪细小病毒。培养病毒用细胞株为Vero和pk-15细胞(由中国药品生物制品检定所引入),培养液为含10%胎牛血清的MEM。实验用胶原贴敷料样品共3批次,为有效期内产品;抗荧光抗体购自中国兽医药品监察所。4.3试验方法：4.3.1细胞毒性测定，用2mol/L氢氧化钠溶液把酸性液态胶原pH调至中性,将pH3.0的酸性溶液和中性溶液进行倍比稀释后加入到细胞中,用MTT染色法测定其对细胞的毒性作用。4.3.2酸性酶解溶液灭活病毒工艺取定量的酸性液态胶原,按9∶1的比例分别加入PRV、VSV、PV1和PPV指示病毒,混匀后立即取部分样品用2mol/L氢氧化钠溶液进行中和,根据细胞毒性测定结果选择样品稀释度作为病毒灭活的起始病毒滴度。其余样品分别于0.5、2、6、24、48、72h取样测病毒残留滴度,计算病毒灭活对数值(LgTCID50/ml)。4.3.360Co-γ射线辐照灭活病毒工艺取定量的液态胶原蛋白,按9:1的比例分别加入PRV、VSV、PV1和PPV指示病毒,混匀后先取出部分样品作为液体对照,并测定起始病毒滴度。剩余样品分装成5ml/瓶进行冷冻干燥,取出2瓶冻干品作为对照。将冷冻干燥的瓶装胶原蛋白经10-15kGy剂量的电子束射线辐照灭活病毒处理(绍兴华能电子加速器有限公司)。辐照后的样品溶解后测病毒残留滴度,对照样品则根据细胞毒性测定结果选择样品稀释度作为病毒灭活的起始病毒滴度,计算病毒灭活对数值。4.3.4存活病毒滴度测定采用微量细胞病变法。试验样品经10倍系列稀释后加入已接种细胞的96孔培养板中,每个稀释度做8孔重复。将培养板置37℃二氧化碳孵箱内培养72h(接种PPV的PK-15培养120h),在光镜下观察细胞病变效应(CPE),根据Karber氏法计算病毒滴度。4.3.5免疫荧光染色法检测PPV将PPV接种于PK-15细胞中,培养120h后,用抗PPV荧光抗体对细胞进行直接免疫荧光抗体试验,按照抗体说明书要求进行操作。4.3.6细胞盲传病毒灭活后的样品均以高浓度加入细胞中做细胞盲传3代培养,观察是否出现细胞病变。在细胞盲传3代的全过程中,任何时段出现细胞病变均视为阳性(+),说明病毒未被完全灭活;未出现细胞病变视为阴性(-),说明样品中病毒已被完全灭活。4、4效果的判定判断病毒去除/灭活的有效性须综合考虑，不能仅以病毒去除/灭活的量来确定。在确定有效之前，必须考虑如下因素，审慎评价每次验证结果。4.4.1．验证试验所选择的病毒是否适宜，病毒验证的设计是否合理。4.4.2．病毒降低量（log10）≥4logs，表示该步骤去除/灭活病毒有效。如因检测方法造成病毒降低量＜4logs时，应盲传三代，如无病毒检出，可认定是有效的灭活病毒方法。4.4.3．病毒灭活动力学可更好的显示病毒灭活的效果。病毒灭活通常不是简单的一级反应。往往是起始反应速率快，其后变慢。如果病毒灭活速率随时间明显降低，表示该方法可能无效，或者残留的指示病毒对该灭活方法有抵抗力，说明该步病毒灭活方法无效。4.4.4．病毒实际滴度为基础病毒，指示病毒与样品1:9的比例混匀后零点取样的病毒滴度，通过与经去除/灭活病毒后的测定的实际病毒残留量的比较，作为该病毒去除/灭活方法（步骤）实际的灭活病毒的量。5.验证要求5.1达到病毒灭活的有效性。5.2得出病毒灭活速率和灭活曲线。5.3确定预定去除/灭活病毒效果的参数及允许变化的幅度。5.4确定指示病毒滴度。5.5加入的病毒与待验证样品体积比不高于1∶9。5.6验证过程中每步取出的样品直接进行病毒滴定。6.工艺参数的确定6.1对确定的参数进行试模。6.2确认的工艺参数及相关文件由技术部汇总存档。7.记录7.1记录归档质量管理部。病毒灭活验证最终报告1、目的：所有用于医疗器械生产的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，为验证“------”的生物原材料-----种猪细小病毒、伪狂犬病毒病毒的感染情况，特进行下述实验。验证确保生物原材料的安全性。验证依据：《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》2、范围：适用于本公司------产品。3、试验结果如下：3.1酸性酶解溶液工艺灭活效果接种在胶原蛋白中病毒经酸性酶解溶液处理2h以上,连续3次重复试验结果表明,对VSV、PRV、PVI和PPV的灭活对数值分别为5.54、5.71、6.30和5.13(表1)。处理后的样品经细胞盲传3代培养,均未出现细胞病变。结果显示,酸性酶解溶液对胶原蛋白中的病毒具有良好的灭活效果。3.260Co-γ射线灭活效果经照射剂量为12.3kGy的60Co-γ射线辐照灭活工艺处理结果表明,接种在胶原蛋白海绵中的VSV、PRV、PVI和PPV指示病毒灭活对数值分别为6.00、5.75、6.00和5.00(表2)。灭活后的样品经细胞盲传3代均未见细胞病变出现。4、验证结果分析与评价在样品中病毒滴度与理论值相符合。经模拟工艺处理后，未检测出指示病毒，证明本工艺可以灭活病毒。病毒灭活判定为有效。部门姓名分析、评价日期最终批准批准人：日期：