农杆菌转化原理及技术

农杆菌介导的水稻遗传转化原理及技术颜静宛水稻遗传转化已成为水稻分子生物学研究和遗传改良的重要技术基础几种常用植物基因转化方法的比较转化方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单无嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛农杆菌介导法的优点操作简便外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝转移DNA片段明确可转移大片段DNA可直接用不同的植物组织进行基因转移农杆菌介导遗传转化的原理农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌（导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤，冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒（Ti质粒）。根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区（Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部分，其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。T-DNA区左右边界各有25bp的重复序列，其中14bp是核心，分10bp（CAGGAATATAT)和4bp（GTAA)不连续的两组，是完全保守的。Vir区为30Kb,由VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、VirH等七个操纵子共24个基因起共调控作用。Ti质粒结构示意图农杆菌侵染过程损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和virG基因,再诱导Vir区的其他基因;Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移;T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上;T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素;农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因(ocs),该基因启动合成各种酶,分解植物细胞产生的冠瘿碱作为惟一的碳源和氮源;冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti质粒的接合转移,扩大侵染范围根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因导入植物细胞并整合到核DNA上。BiologyofA.tumefaciensWellknowntoinducecrowngalltumorA.tumefacienslivesaroundrootsurfaces(inrhizosphere)whereitusingnutrientsthatleakfromtheroottissuesinfectsonlythroughwoundsitesandactivelychemotactictothemPlantwoundproducesacetosyringoneBacterialT-plasmidproducesreceptorsforacetosyringoneProducecallustransformcallusstimulateshootingbycytokininaddition+cytokininThisprocedureiseasyfordicotyledoneplants(legumesetc)AgrobacteriumTiplasmidwiththenewgenePlantcellcell’sDNATransgenicplantCelldivisionThenewgene+TransformationAgrobacteriumtumefaciensAgrobacteriumtumefaciens农杆菌介导转化水稻的方法水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程愈伤诱导共培养抗性愈伤的筛选与再生成完整植株整个操作过程约需8天第一天（预培养）第三天（划菌）第五天（侵染、共培养)第八天（脱菌、筛选）NB培养基为基本培养基加入相应植物生长调节剂技术关键：诱导与培养“状态良好”的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继代次数不超过8代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效去除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合适的抗生素及其浓度）；快速筛选（2-3次筛选）；迅速分化再生。一、培养基基本培养基为NB培养基，愈伤诱导、转化及分化等培养基配方如下：1.诱导培养基：NB+2,4-D2mg·L-1；pH5.8-5.9。2.预培养培养基：NB+2,4-D2mg·L-1；pH5.8-5.9。3.共培养培养基：NB+2,4-D2mg·L-1+AS100µM·L-1；pH5.2。4.选择培养基：NB+2,4-D2mg·L-1+羧苄青霉素250mg·L-1+Hyg30-50mg·L-1，pH5.8-5.9。5.分化培养基：NB+KT10mg·L-1+NAA0.4mg·L-1；pH5.8-5.9。6.生根培养基：1/2MS；pH5.8-5.9。二、胚性愈伤组织的诱导及继代取水稻授粉后15-20d的未成熟穗，将未成熟种子剥壳，用75%乙醇浸泡1min，再转入25％的次氯酸钠溶液中振荡灭菌25min，于超净工作台中无菌水冲洗3-5次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱导培养基中，每皿约30粒，于28℃暗培养7d，切除胚根，继续培养7d，待愈伤长大后进行继代培养。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化。胚性愈伤三、农杆菌介导转化水稻1.愈伤组织的预培养选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状愈伤，转接到预培养培养基中，置于27℃暗培养4天。2.农杆菌的培养及处理从低温（-85℃）冻存管中刮取少量菌液于附加Kan50mg·L-1和Rif50mg·L-1YEB固体培养基划线，然后在28℃暗培养36~72h进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃培养两天后，用适量添加有100µM·L-1乙酰丁香酮（AS）的AAM培养基将菌洗脱，悬浮于添加有100µM·L-1乙酰丁香酮20mlAAM培养基中，剧烈摇动1min后，调整菌液浓度至OD600nm=1.5~2.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液。3.共培养取经预培养的愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃暗培养3d。4.洗除农杆菌挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250mg·L-1羧苄青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干。5.愈伤组织的筛选将愈伤转移至选择培养基筛选抗性愈伤，每两周转接1次。抗性愈伤非抗性愈伤6.抗性愈伤组织的继代与植株的再生每两周将愈伤转移至新选择培养基上，约需三周即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化培养基上。2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上，每培养瓶1个克隆。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至温室盆栽。抗性愈伤的分化抗性苗的生根转基因植株田间种植转化率、分化率和共转化率的计算抗性愈伤获得率（%）=抗性克隆数/转化克隆数×100%绿苗率（%）=再生克隆数/抗性克隆数×100%