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植物显微制片技术——石蜡切片法南京师范大学生命科学学院•在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前，必须根据植物材料的特性，采用不同的方法，对植物材料进行处理，把材料制成透明的玻片标本。根据材料的性质和制作法的不同，常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类，前者常用的有徒手切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡切片法、冷冻切片法等，其中以石蜡切片法最为常用。后者包括整体封藏法、涂布法、压片法等。石蜡切片法•石蜡切片法是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经一系列处理制成永久制片的方法。在研究植物的细胞、组织、胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法。•石蜡切片法的一般流程为：取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片。取材用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。取材的注意事项如下：（1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置对照材料。（2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。雌、雄蕊一般不需分割。（3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时，需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植物细胞分裂活动较明显。（4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）；对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率较低。（二）固定•将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。•良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。常用固定液：简单固定液以一种化学药品配制的固定液。⑴乙醇为凝固型固定剂。常用无水乙醇或95％乙醇。⑵甲醛为非凝固性固定剂。具强烈刺激性气味。纯净的甲醛为无色透明液体。固定用的浓度为4%-10％。⑶醋酸为凝固型固定剂。为无色透明的液体，刺激性极强，低温下凝结成冰，故又名冰醋酸。2.混合固定液：由几种试剂，适量配制而成。混合遵循原则：①优缺点互补；②膨胀与收缩相互平衡；③强氧化剂与还原剂应分别配置。常用混合固定液有下列几种：⑴FAA固定液（福尔马林－冰醋酸－乙醇）广泛适用于根、茎、叶、花药、子房的组织切片，所以又称为万能固定液。一般固定时间不低于24h。该固定液优点是在较低温度下（10℃左右）适用于材料的长期保存，可兼作保存液。并且固定的材料，不妨碍染色，但用于细胞学上的固定效果较差。⑵纳瓦兴(Navaschjn's)固定液1912年首创。适用于细胞学与组织学研究的切片观察。但渗透慢，不能长期保存；主要用于显示分裂相。（三）抽气•植物材料内部多由于含有空气，导致固定液不能完全深入。材料投入固定液后需要立即抽气。以便让固定液有效透入材料组织中，并排除材料内气泡的干扰。•一般抽气时间为20-30min。抽过气的材料在停止抽气，应沉入底部。（四）洗涤•固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶，影响观察；有的还会继续作用，使材料变质等。因此，在使用材料时，需根据固定液的种类，用水、缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液。如：用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次。如用水洗涤，可将材料自固定液中取出，放入指形管，加入半管水，用纱布将管口扎紧，置于水槽内，进行流水冲洗。流水冲洗时间一般为12-24h。（五）脱水•材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分解。而且透明剂与水是不相混合的，不利于材料的透明和包埋等后期处理。因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能与其他有机溶剂互相替代。•脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。（六）透明•透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质，可以将材料中的脱水剂置换出来，使石蜡能顺利进入材料中。•二甲苯是目前应用最广的透明剂，作用迅速，但易使材料变脆。。（七）浸蜡•是指逐步清除材料中的透明剂，以使石蜡充分渗透于材料内部的过程。这样，材料的各部分都能保持原来的结构与位置，切片不致发生破裂或其他变形。•浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇。•每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。（八）包埋•材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡块，以备切片。•操作方法：根据切片材料大小，确定所需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒。（九）切片•即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。（十）贴片•是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色和观察。•常用的粘片剂有下列二种：(1)明胶黏片剂(2)蛋清黏片剂（十一）染色即根据植物细胞中不同的化学性质，用染料分别进行染色，以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等。染色基本程序为脱蜡、染色、分色封片。染色方法可分为下列几类：①单染只用一种染料染色。②双重染色两种染料染色，如番红--固绿；苏木精---曙红。③多重染色多种染料染色，如番红—固绿—桔红G；酸性品红—苯胺蓝—桔红G等。（十二）封藏•封藏于中性树胶中，使材料能在显微镜下清晰地显示出来，并能长期保存。•方法：将含材料的载玻片放在吸水纸上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（必须在二甲苯干燥前进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。