各类干细胞应用特点研究比较

各类干细胞应用特点研究比较徐瑞权干细胞研究的重要性：美国《Science》杂志•1999年——将“干细胞研究的新发现”列入十大科技进展之首•2000年——再次入选年度十大科技进展•2002年——列入值得关注的六大科技领域之一•至今——干细胞各领域的研究飞速发展美国加州每年提供干细胞研究经费达3亿美元•我国有关干细胞的研究也十分活跃，已有多个有关干细胞的“973”项目，召开过多次全国性或国际性学术会议，出版过多本专（译）著。“863”计划近期将为干细胞研究提供2亿元人民币的经费。干细胞治疗的特点1.一次性介入，永久性治疗；2.不需要完全了解疾病发生的确切机理；3.可应用于自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。干细胞应用的基础——调控干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增值和分化进行调控，使之向指定的方向发展。包括：•内源性调控•外源性调控内源性调控干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化：•（1）细胞内蛋白对干细胞分裂的调控：•在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。（2）转录因子的调控•在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4是必需的。Oct4是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团•白血病抑制因子（LIF）•Tcf/Lef转录因子外源性调控•干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响•（1）分泌因子•间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活.有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt信号通路。•干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响•（1）膜蛋白介导的细胞间的相互作用•有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响.•干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响•（3）整合素（Integrin）与细胞外基质•整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。•β1整合素干细胞的分类及特点：•胚胎干细胞•成体干细胞•诱导分化干细胞（iPS），可诱导分化为机体胚胎干细胞成体干细胞①来自胚泡的内细胞群来源于骨髓、外周血、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、齿髓、肝、皮肤、胃肠道粘膜层和胰腺等②发育全能性，可诱导分化为机体分化较局限，部分成体干细胞（造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞）有一定跨系、跨胚层的“可塑性”③无限的自我更新能力病理条件下才显出一定的自我更新潜能④增殖能力强，便于应用增殖能力较弱，故不能完全取代胚胎干细胞⑤细胞可不断增殖，“永生化”，移植后有形成肿瘤的可能性成瘤的可能性很小⑥不能自体移植自体移植可避免免疫排斥⑦有伦理问题分离和使用不存在伦理问题胚胎干细胞•1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.永生化(immortal)；3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.能参与胎儿所有组织的发育过程；胚胎干细胞的性质胚胎干细胞系的建立过程分离囊胚的内细胞群与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖分离胚胎生殖腺脊细胞------胚胎干细胞的鉴定------定向诱导分化-------成体干细胞-----功能细胞研究意义人胚胎发育机制及影响因素的研究。用于药物机理及毒性实验的研究，减少人体和动物的实验及临床研究。将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体细胞、组织和器官。ES细胞研究的趋势•改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得ES细胞的方法。•定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。•成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？胚胎干细胞的特点增殖速度：18－24h分裂增殖一次•hES必须在含有白血病抑止因子（LIF）的培养基及成纤维细胞饲养层(freedercell)条件下才能保持繁殖而不分化。•hES体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖而抑止其分化。•具有分化形成外、中、内三个胚层的潜能。•能形成嵌合体动物，从而成为联系细胞和个体之间的桥梁。鉴定：人胚胎干细胞特异表面抗原的表达胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4Thmoson分离的hES阴性弱阳性强阳性Gearhart分离的hES阳性弱阳性阳性小鼠ES阴性阴性阳性鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。Gearhart等认为SSEA-1阳性可能是源于原始生殖细胞的多能干细胞分化的标志.细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81a胚胎干细胞具有正常稳定的二倍体核型和带型。b胚胎干细胞具有较高的端粒酶活性及碱性磷酸酶的表达。人胚胎干细胞系端粒酶活性都很高，说明其可在体外未分化状态进行长期培养。鉴定.具有转录因子Oct-4的表达Oct-4只限定在多潜能细胞中表达。人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因子Oct-4，当胚胎干细胞分化时，其表达能力大大降低。Oct-4可能是哺乳动物不同发育阶段多潜能细胞所特有的少数特异的调控分子之一。胚胎干细胞鉴别鉴别•不被Hoechst33342和Rhodamine123染色•能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植•入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤•可诱导分化为各种成体干细胞注：人胚胎干细胞具有自我更新和多潜能的特性，以及以下一些特征：1）可以从囊泡的内细胞团中分离出来；2）在体外的增殖力非常强；3）在继代的培养过程中保持正常的多倍体核型；4）可以分化为三个胚层的细胞；5）具有端粒酶活性内细胞群的细胞可以发育成除了胎盘以外的完整个体，因而这些细胞被认为具有全能性。胚胎干细胞的优点——全能性1.ES细胞的全能性主要体现在以下几方面：•①形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；•②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三个胚层组织；•③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；•④形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。ES细胞生物学特性•细胞形态结构及核型•细胞的高度分化潜能•碱性磷酸酶的表达•胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达1.各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。2.ES细胞与卵圆柱期（eggcylinderstage）胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与ICM细胞有差异。3.细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。4.ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。5.ES细胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。6.此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。1、ES细胞形态结构及核型2、ES细胞的高度分化潜能ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点1.ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。2.在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：“简单类胚体”“囊状胚体”细胞分化物。3.ES细胞可进行诱导分化*用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90％以上的ES细胞分化为神经胶质细胞。*聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。*将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。*用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。3.碱性磷酸酶的表达许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。4、胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA－1的表达。小鼠SSEA－1的表达自8一细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。ES细胞的应用前景•（1）ES细胞在动物克隆及人类治疗性克隆中的应用•（2）在转基因动物中的应用•（3）制备嵌合体动物ES研究面临的难题1、体外培养ES细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。如何平衡这一对矛盾,必须筛选适宜的培养条件。目前在ES细胞研究中存在着建系成功率也不高等问题,只在小鼠中建立了稳定的ES细胞系，家畜、人类细胞系建立的最佳条件仍无定论。2、ES细胞高度未分化,具有形成畸胎瘤的可能性,因此在使用ES细胞进行治疗前必须首先体外诱导ES细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因,当移植的细胞向肿瘤发展时,自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导ES细胞定向分化成单一类型的分化细胞,是至今仍未解决的难题。因此，必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。3、ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程,很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机体的器官,要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到,器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。4、最大的障碍来自于伦理学问题，特别是ES细胞应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类ES细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，但随着观念的改变，人们会逐渐认识到ES细胞对临床医学及生物学理论研究的重要作用。[WASHINGTON]TheUSNationalInstitutesofHealth(NIH)couldprovidefundingforresearchonhumanembryonicstemcellsasearlyasthespringifnewguidelines,publishedbytheNIHlastweekafterwidespreadpublicconsultation,areformallyapproved.Nature402,566(1999)[TOKYO]Japan'scloningbanwillstillallowstemcellexperimentsNature404,321(2000)[LONDON]Europeanpanelrejectscreati