氧化应激(秦教授)

1氧化应激与糖尿病肾病秦贵军郑州大学第一附属医院内分泌科2糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）系慢性高血糖所致的肾脏损害，病变可累及全肾，是导致终末期肾衰竭的主要因素。研究表明糖尿病肾病约占新诊断终末期肾功能衰竭的40%，伴有终末期肾脏疾病的糖尿病患者5年生存率只有20%。ChoudhuryD,etal.DiscovMed,2010,10(54):406-415.我国糖尿病肾脏病变的患病率32009年至2013年文献报道的我国社区2型糖尿病患者DN患病率为10%~40%。糖尿病与心血管疾病行动研究（ADVANCE）已证实即使在相同的降糖、降压条件下，亚洲2型糖尿病患者总肾脏事件的发生风险比经济发达地区高出73%。我国DN在终末期肾病（ESRD）中占16.4%，且未来可能会成为ESRD的首位病因。徐嵘,等.中华内科杂志,2012,51(1):18-23.柯萧韵,等.中国全科医,2013,16(12):1373-1375.LiuZH.NatRevNephrol,2013,9(9):523-528.WoodwardM,etal.DiabetesCare,2011,34(12):2491-2495.糖尿病肾病发病机制（一）遗传因素（二）代谢与血液动力的影响（三）肾小球滤过屏障功能改变（四）蛋白质的非酶糖化（五）多元醇通路活性增加与肌醇代谢紊乱（六）高血压（七）激素和细胞因子（八）反应氧中间产物《糖尿病学》，主编：许曼音2001年Brownlee提出糖尿病肾病的统一机制学说，认为经典的多元醇途径、糖基化终末产物途径、蛋白激酶C途径和氨基己糖途径均是高糖环境下线粒体呼吸链中ROS生成过多的结果，即高糖损伤的共同基础—“氧化应激”。5BrownleeM,etal.Nature,2001,414(6865):813-820.氧化应激是机体正常氧化/还原动态平衡被打破，造成生物大分子氧化损伤，干扰正常生命活动的一种严重应激状态。氧化应激产物（ROS）主要包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（OH-）等活性含氧化合物。6氧化应激高血糖作为糖尿病并发症发生的启动因素，导致氧化应激水平升高和ROS、非酶的糖基化蛋白和葡萄糖的自身氧化增加；长期高血糖导致ROS产生增多，氧化应激水平升高，损伤肾脏组织，从而导致了DN的发生。7氧化应激与DN动物研究发现，单一剂量链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠在8周病程时已经出现肾功能损害，同时伴随氧化应激水平升高、肾脏丙二醛（MDA)含量增加；体外研究发现，糖尿病大鼠近端肾小管细胞经分离后暴露于氧化剂中，活性氧自由基和细胞凋亡增加。8氧化应激与DNXuM,etal.AmJNephrol,2009,29(3):252-256.ZhangQ,etal.ToxicolApplPhamacol,2009,241(1):1-13.虽然越来越多的研究表明氧化应激在DN的发生发展中起重要作用，但是其具体机制目前尚不十分清楚。糖尿病肾组织中氧化应激增强主要有两个原因，即：肾组织中ROS产生增多及ROS清除减少。9DN氧化应激发生的机制主要包括以下机制：一、线粒体呼吸传递链：高糖环境下线粒体功能障碍，激活氧化应激通路，导致组织损伤。二、糖基化终产物（AGE）途径：长期高血糖造成AGE堆积，多元醇途径增强亦引起AGEs生成增多，而AGE形成过程中可不断产生氧自由基。10肾组织中ROS产生增加三、还原型辅酶II（NADPH）氧化酶：糖尿病时，高血糖、高脂血症、细胞因子、生长因子、血管紧张素II等各种途径活化NADPH氧化酶，产生大量ROS。四、细胞因子和生长因子信号转导和放大：高血糖诱导细胞因子和生长因子（如，TGF-β1、NF-κB、PKC等）过度表达，可诱导ROS的合成。11肾组织中ROS产生增加五、山梨醇/多元醇途径活性增高：糖尿病时，葡萄糖生成大量山梨醇，一方面引起细胞水肿和损伤；另一方面使还原型谷胱甘肽减少，诱导ROS合成。六、NO/解偶联一氧化氮合成酶（NOS）：在糖尿病患者，NOS解偶联受到底物L-精氨酸可用性的限制或辅助因子缺乏影响，被认为是NO产生氧自由基的原因。12肾组织中ROS产生增加高血糖时，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶的基因表达下调，活性下降，机体清除ROS能力受损；此外，体内非酶类抗氧化剂水平降低，使肾组织抗氧化能力显著降低。13肾组织中ROS清除减少一、对肾血流动力学的影响：ROS可使肾血管通透性增加，血管内皮功能障碍等；当血管动力学发生变化，功能异常的细胞会产生大量ROS，导致进一步的损伤。二、肾内基质重构及肾小管间质纤维化：糖尿病及高血糖状态下，氧化损伤可使肾脏内基质构建，组织纤维化，促进DN的发生。14氧化应激对糖尿病肾脏组织的可能损害三、肾组织炎症的发生：糖尿病时存在的高血糖及血流动力学障碍等可损伤肾脏固有细胞，释放炎症因子和炎症介质（如肿瘤坏死因子-α、NF-κB等），加重肾细胞损伤，促进纤维化的发生。四、足细胞损伤：高血糖可通过ROS使足细胞标志蛋白表达减少，足突消失融合；ROS亦可通过激活促凋亡因子诱导足细胞凋亡。15氧化应激对糖尿病肾脏组织的可能损害16高血糖和氧化应激葡萄糖毒性是指长期异常升高的血糖对β细胞的毒性作用；大量临床研究发现2型糖尿病患者处于氧化应激状态。葡萄糖自身可通过多种途径产生活性氧。如下图：17胰岛素抵抗和氧化应激胰岛素对AngII的I型受体有上调作用，并可激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，而全身和局部组织AngII水平增高是胰岛素抵抗导致氧化应激的重要机制。氧化应激亦可加剧胰岛素抵抗的程度，其通过诱发多种丝氨酸激酶的级联反应影响胰岛素信号转导。18游离脂肪酸和氧化应激游离脂肪酸（FFA）水平增高可使线粒体功能发生障碍，导致ROS产生，超氧分子的形成及氧化磷酸化的解偶联等。同时，FFA可减少细胞内的还原型谷胱甘肽水平，造成内源性抗氧化功能的障碍。FoxO亚家族（FoxOs）是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子。研究表明其可通过激活下游抗氧化靶基因如锰超氧化物歧化酶（MnSOD）及过氧化氢酶（CAT）等的表达，发挥抗氧化应激作用。19KousteniS.Bone,2012,50(2):437-443.Furukawa-HibiY,etal.AntioxidRedoxSignal,2005,7(5-6):752-760.FoxOs与氧化应激Kato等研究表明在STZ诱导的糖尿病大鼠肾皮质中FoxO1、FoxO3a磷酸化水平增高（图A）。研究发现在STZ诱导的糖尿病大鼠肾皮质中，FoxO1磷酸化水平升高（图B），肾皮质MDA含量明显增加（图C）。说明高血糖状态下肾脏氧化应激的发生可能与FoxO1抗氧化活性降低有关。20FoxOs在糖尿病肾脏中活性下降KatoM,etal.JAmSocNephrol,2006,17:3325–3335.WuL,etal.MolBiolRep,2012,39(9):9085-9093.ABC21Venkatesan等研究表明在体外培养的肾小球系膜细胞（MCs）中H2O2通过PI3K/AKT信号通路作用于FoxO1，使其磷酸化水平升高，活性降低，从而下调其靶基因过氧化氢酶的表达。FoxO1调节系膜细胞ROS水平VenkatesanB,eral.JCellPhysiol,2007,211:457–467.22Venkatesan等研究发现过表达FoxO1可增加H2O2处理的MCs中过氧化氢酶的表达，下调ROS水平。研究发现上调高糖培养的MCs中FoxO1表达及活性，其抗氧化靶基因MnSOD表达升高（图A），MCs中ROS水平下降（图B）。上调FoxO1表达降低系膜细胞ROS水平VenkatesanB,eral.JCellPhysiol,2007,211:457–467.JiH,etal.MolBiolRep,2014,41:2151–2159.AB糖尿病肾病的治疗发生糖尿病肾病的危险因素•不可改变的因素–年龄–性别–糖尿病病程–遗传•可改变的因素–高血压–高血糖–血脂代谢异常–血液高凝状态2007年NKF指南（第一个针对DM并发CKD指南）DM并发CKD治疗的指南及建议DN治疗原则2014年糖尿病肾病防治专家共识营养治疗调脂治疗控制血压减少尿蛋白控制血糖综合治疗抗氧化应激2007NKF糖尿病和慢性肾脏病临床实践指南DN治疗原则UKPDSGroup.Lancet.1998;352:837-853.Over10years,HbA1cwas7.0%(6.2-8.2)intheintensivegroup(n=2,729)comparedwith7.9%(6.9-8.8)intheconventionalgroup(n=1,138).UKPDS：强化血糖控制减少并发症的相对危险DCCT&EDIC：严格控糖可延缓DN病程进展DeBoerIH,etal.ArchInternMed,2011,171:412-20.29虽然DCCT和UKPDS均证实强化血糖控制可显著降低DM患者肾脏并发症的发生率，但未涉及其具体机制，这种获益是否和降低了氧化应激水平有关无从得知。30和造模成功后即开始强化血糖控制的DM大鼠相比，造模成功6月后才开始强化血糖控制的大鼠肾皮质过氧化脂质和NO水平增高，GSH降低，提示早期强化血糖控制能减少DN的发生可能和氧化应激的减轻有关。***•%0•-10•-20•-30•-40•-50*P0.05与严格的血糖控制相比严格的血糖控制严格的血压控制中风糖尿病终点事件糖尿病死亡微血管合并症BakrisGL,etal.AmericanJournalofKidneyDiseases,2000:646-661.DN严格控制血压较血糖更重要*常用降压药物的抗氧化应激机制ARB可以降低DN患者尿8-羟基-脱氧鸟苷和8-异构-前列腺素F2水平，并切断高血糖-活性氧簇-AngII-血管紧张素II受体-活性氧簇的恶性循环。硝苯地平可以降低暴露于AGE中的肾脏系膜细胞AGERmRNA的表达水平，进而减少ROS的产生。32OqawaS,etal.BiomarkInsights,2009,4:97-102.MatsuiT,etal.BiochemBiophysResCommum,2009,385:269-272.生活方式干预是DN的基础治疗手段，有研究发现其在降低DN肾脏氧化应激水平方面同样具有重要作用。DN患者连续6个月每天饮用118ml红酒后，24h尿蛋白和8-OHdG浓度降低，提示红酒的肾脏保护作用可能和降低氧化应激水平有关。NakamuraT,etal.Metabolism,2009,58:1185-1190.34白藜芦醇是一种天然的具有生物学活性的抗氧化剂，主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中。研究发现白藜芦醇能减少肾脏活性氧产生，肾皮质纤连蛋白、胶原IV表达降低（如图），对糖尿病大鼠肾脏有保护作用。WuL,etal.MolBiolRep,2012,39(9):9085-9093.35注：A为NC组；B为DM组；C为RSV组与NC组比较，*P﹤0.05；与DM组比较，#P﹤0.05白藜芦醇治疗能增加STZ诱导的糖尿病大鼠FoxO1活性，保护肾脏功能WuL,etal.MolBiolRep,2012,39(9):9085-9093.KimMY,etal.Diabetologia,2013,56:204-217.白藜芦醇治疗能降低db/db小鼠肾脏8-OH-dG表达，保护肾脏功能接受DPP-4抑制剂联合ARB治疗的DN患者尿蛋白和8-OHdG水平降低FujitaH,etal.EndocrineJournal,2014,61:159-166.氧化应激在DN的发生发展中起重要作用，降低氧化应激水平已成为治疗DN的主要目标之一。目前关于抗氧化应激治疗DN的分子机制研究多局限于动物实验，这些研究结果最终运用于临床，将使D