考马斯亮蓝法测定蛋白浓度

考马斯亮蓝法测定蛋白浓度一、实验原理考马斯亮蓝G250比色法，也被称为Bradford法是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。考马斯亮蓝G250是一种染料，能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质-染料复合物，颜色由红色转变为蓝色，最大光吸收波长为595nm，并且在低浓度范围（0.01~1.0mg/mL）内，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。二、实验材料1、实验设备电子天平、分光光度计、恒温水浴锅2、试剂考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、NaCl、95%乙醇、85%磷酸三、操作步骤（一）试剂配制1、考马斯亮蓝G250溶液配制准确称取0.1g考马斯亮蓝G250，溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%磷酸，最后用蒸馏水稀释定容到1000mL。备注：考马斯亮蓝G250溶液的用量100mL足够。2、牛血清蛋白溶液配制准确称取50mg牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容到500mL，配制成浓度为100μg/mL的牛血清蛋白原液。（二）标准曲线的制作1、取5-7支试管，分别准确配制不同浓度梯度的牛血清蛋白溶液（浓度控制在10~100μg/mL范围内）1mL，具体操作：取100-900μl牛血清蛋白原液，水补足到1mL，浓度相当于所取原液量的十分之一；2、在不同浓度的1mL牛血清蛋白溶液中，分别加入5mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，置于25℃水浴保温10min；3、以1mL蒸馏水加5mL考马斯亮蓝溶液为空白对照，冷却后测定波长595nm处的吸光值；4、以配制的标准蛋白浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标制作标准曲线，并做线性回归分析，求线性方程。（三）目标样品的蛋白浓度测定取目标蛋白样品按标准曲线方法测定A595。依据线性方程计算目标样品的蛋白质浓度。五、注意事项1、染料-蛋白复合物形成受温度和时间影响较大，反应需控制在同一条件下进行。2、比色杯易受蓝色污染，应注意用乙醇清洗。