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!复旦学报!医学版!#$%&%’()*+#,-’!#*$.#$%!$!/011+230%#’%4$5601!789$’:$B:R$%48269!(’3;2’%$;-09EMD)蛋白质芯片技术在肝癌研究中的进展李长煜#综述$!王小林#审校$!复旦大学附属中山医院放射科!上海!!$!摘要#!,7=DE蛋白质芯片技术是一种快速%简便易行和高通量的蛋白质组学研究方法#在肝癌研究中具有广阔的应用前景&本文就其技术原理%临床应用作一综述&关键词#!,7=DE蛋白质芯片技术(!蛋白质组学(!肝细胞癌中图分类号#!%$(;%!!文献标志码#!A!=1B09L018896EMD)534=184?96=1B;4971:::;07;075390%;=E/6$%48.#NAFMP’$08:’%!#$%&’(#)’*+%64*.*/0#E3*)/-3%)1*-$4’%.#526%)7)48#&-4’0#93%)/3%4!$!#:34)%)&’840;74*!,7=DE8L!8*,3105+’%-6’3$11$.5+-6%0:04.’2$S’-?#2’93:+$%#6’46856104635$%$:.T’%49+560#0C3105+09’-2$%#6$2R’#+$33:’-$5’0%’%56+1+2+$1-60C6+3$50-+:::$1-$1-’%019$;6’2$15’-:+299$1’T+256+31’%-’3:+0C,7=DE8L!8*,3105+’%-6’3$11$.5+-6%0:04.$%#$#($%-+9+%52’%-:’%’-$:31$-5’-$:$33:’-$5’0%2’%1+-+%5.+$12;)J1?C908*!,7=DE8L!8*,(!3105+09’-2(!6+3$50-+:::$1-$1-’%019$!!原发性肝癌!31’9$1.:’(+1-$%-+1#J=/#以下简称肝癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一#其中&H为肝细胞肝癌!6+3$50-+:::$1-$1-’%09$#I//&在世界范围内#其发病率呈现上升的趋势&我国是肝癌大国#全球新发肝癌病例中(H发生于中国,#-#在常见肿瘤中仅次于肺癌#居第!位&肝癌的早期诊断%及时有效的治疗和治疗后的随访是目前肝癌研究的主要内容&甲胎蛋白!A!J作为血清肿瘤标志物已广泛用于I//的检测#但近年来大量临床研究表明#A!J诊断肝癌的敏感性和特异性仅分别为’H$+(H和%+H$&+H,!-&因此寻求一种新的灵敏度高和特异性强的I//肿瘤标志物迫在眉睫&#&&’年#澳大利亚*$-S$1’+大学的N’:?’%2和N’::’$92首先提出蛋白质组的概念#系指0一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质1,$-&而蛋白质组学则是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学#其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分%表达水平与修饰状态%了解蛋白质之间的相互作用与联系#揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律&肿瘤性疾病从蛋白质组学角度又被认为是一种蛋白质缺陷病#在其发生发展的不同阶段#即使在没有任何症状的早期或癌前病变期#在蛋白质水平上往往就已经发生了变化&在临床深入研究肝癌患者的蛋白质谱的变化#对揭示和发现肝癌发生%发展的规律有重要意义&蛋白质组学是一个迅速发展的领域#为肝癌早期诊断和标志物鉴定提供了新思路,’-&表面加强激光解析电离飞行时间质谱!21C$-++%6$%-+#:$2+1#+2013$5’0%’’0%’T$5’0%5’9+0CC:’4659$2223+-5102-03.#,7=DE8L!8*,技术是一种快速%简便易行和高通量的蛋白质组学研究方法#其综合了芯片微阵列技术与质谱的优点#大大提高了对蛋白质的鉴定能力#可用于生物标记物发现%鉴定和蛋白质谱的分析能力&国内外已经采用此方法和技术手段筛选了卵巢癌%乳腺癌%肺癌%前列腺癌等肿瘤的血清特异性蛋白质生物标志物&本文就其在肝癌研究中的进展情况综述如下&EMD)蛋白芯片技术概述!由美国/’36+14+%G’02.25+92公司在#&&%年研发成功的,7=DE8L!8*,蛋白质芯片平台是蛋白质芯片和质谱技术的结合#是集分离%纯化%鉴定%检测以及数据分析为一体的工具#主要由蛋白质芯片%芯片阅读器和生物信息学三大部分组成#可直接分析患者血清%淋巴液%脑脊液%尿液%细胞分泌液等样品而无需复杂的样品制备,(-&蛋白质芯片是,7=DE技术的核心#根据其性质的不同可分为化学表面芯片和生物表面芯片&化学表面芯片包括$疏水表面!I’芯片%亲水表面!FJ芯片%强阴离子交换表面!,AP芯片%弱阳离子交换表面!N/P芯片%金属离子螯合表面!E*A/芯片等(种#主要用于检测未知蛋白&生物表面芯片可分为抗原8抗体%受体8配体%DFA8蛋白质及酶8底物芯片等#通过特异性结合机制检测样本中的靶蛋白&目前#肿瘤相关标志物的研究主要采用化学表面芯片,+-&,7=DE的基本原理是给予特殊芯片的表面加强吸附#复杂的生物样品如血清%细胞中的蛋白质通过特定的芯片表面被吸附到芯片上#再洗脱去非特异性结合蛋白质后加上能量’%$!李长煜#等;,7=DE蛋白质芯片技术在肝癌研究中的进展吸收分子#与蛋白形成混合结晶#促进蛋白质的解析和离子化#利用激光脉冲辐射便把被结合的蛋白质解析而形成荷电离子#质荷比不同的离子在真空场中飞行时间长短不一&检测器可将其捕获并绘制成质谱图#经电脑处理后直接显示样本中各种蛋白质的相对分子质量%含量等信息#可将正常人或某些疾病患者的蛋白质指纹图谱甚至基因库中的指纹图谱进行相互对照比较#从而发现和捕获到疾病中新的特异性相关蛋白质及标志物,%#)-&传统的蛋白质组学研究方法主要有二维电泳法!!8D7%基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱技术!*A=DE8L!8*,和电喷雾离子化技术!7,E&这些技术都有各其局限性#!8D7分辨出大量的可溶性蛋白质#分析蛋白质的相对分子质量在$/#$以上时电泳图谱较清楚#并能提供待检蛋白质的较为详细资料#但凝胶上蛋白质的检出率仅为(H$%(H&对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被染色而漏检#对相对分子质量过大或过小%酸性或碱性以及膜蛋白等难溶蛋白质检出的敏感性较低#并且检测工作量大%对染色及转移等要求较高%难以定量和自动化&*A=DE可因凝胶分离蛋白#水溶性蛋白等的稳定性和可溶性条件影响离子化信号的发生#7,E对实验中使用的去污剂敏感#样品与可溶性基质结晶易产生混淆的质谱信号&而,7=DE质谱技术将芯片技术和质谱技术相结合#分析过程不会破坏蛋白质#整合蛋白质样品处理%生化反应及检测分析过程于一体#实现了新型%高效%快速%高通量的检测&与传统测定技术相比具有以下优势$.待测样品来源广#如血清%尿液%体液%脑脊液%细胞培养液%组织提取物等#可直接点样#无需特殊处理(/在同一系统中集分离%纯化%鉴定%检测和数据分析为一体#高通量%操作自动化#快捷方便(0对样品需要量极少#只需;($(#=或!($(个细胞即可检测(1检测灵敏度高#适合低丰度小分子量蛋白质的发现#并能检测疏水蛋白质特别是膜蛋白质(2对样品中的盐和其他杂质有较高的兼容性,&-&临床应用!乙肝肝硬化是我国常见的疾病之一#在肝炎%肝硬化基础上发生发展的肝癌的病死率在恶性肿瘤中居第$位#仅次于胃癌与食管癌#严重地威胁着人们的健康&利用,7=DE技术#通过分析和监视相应蛋白质的变化%作用#能够及时掌握患者病程的特点和进展的趋势#从而有利于肝病的诊断%鉴别诊断和建立个体化治疗方案,#-&N$%4等,##-选取#+个血清标本!其中(!例为原发性肝癌患者标本#!!例为肝硬化患者标本#$!例为健康志愿者标本#先随机分成训练组和测试组&通过对训练组的分析建立一个早期肝癌的人工智能诊断模型#然后应用盲法对测试组进行测试以检验此诊断模型&最后#应用此模型对原发性肝癌组和正常组#原发性肝癌组和肝硬化组的蛋白质组指纹进行对照比较#发现肝癌组和正常组间仅在$#(*’Q和(&*’Q的两个蛋白峰值处有显著性差异&基于这两个蛋白质点建立的人工智能诊断模型在比较肝癌组和正常组的敏感性和特异性均为#H#以同样的方法对肝癌组和肝硬化组进行比较#敏感性为)!H#特异性为#H&为探讨肝癌门静脉癌栓形成的可能分子机制#黄成等,#!-收集#$(例肝癌患者血清#分为建模型组和盲法验证组两组#采用弱阳离子交换蛋白质芯片!N/P!为检测介质#经,7=DE8L!8*,技术#通过软件分析检测出#个蛋白峰中共有#+个蛋白峰有显著差异#这#+个蛋白分子标记物可能与门静脉癌栓形成有关&M+#O等,#$-研究了%#个从肝硬化到肝癌不同病理阶段的小结节病灶组织&这些标本来自#例女性肝硬化合并肝癌患者手术切除肝组织&应用激光捕获显微切割!=/*联合,7=DE蛋白芯片技术筛选出(个差异蛋白峰#其中相对分子质量为#&!%(’!(和+!#$$等$个蛋白峰表达差异有统计学意义&作者认为=/*联合,7=DE蛋白质芯片技术可为肝硬化恶变为肝癌的分子机制研究提供新途径&采用,7=DE8L!8*,技术确定血清的多个蛋白质生物标志物#可用于监测慢性丙型肝炎向肝细胞癌的进展&U$%91$等,#’-采用,7=DE蛋白质芯片技术研究了#($例诊断为丙型肝炎患者的血清#其中部分患者同时诊断为肝细胞癌#其余癌为阴性(结果发现+个蛋白差异峰具有统计学意义#表明利用,7=DE蛋白质芯片技术对于早期检测伴发丙型肝炎肝细胞癌患者血清具有一定的意义&N$1#等,#(-用,7=DE方法检测了)’例丙肝肝硬化患者和+例丙肝基础的肝癌患者血清中的蛋白质相对含量#并用人工智能网络对$)例患者进行验证&结果发现有#%个峰点有显著性差异#其中E4M对于活动性慢性肝病患者最具有预测性诊断价值#敏感性为&’H#特异性为)+H#在肝癌中峰点(;)/#$表达增高#$$;!%++;’和#!/#$表达下调&J$1$#’2等,#+-用,7=DE8L!8*,分析)!例肝硬化伴或不伴肝癌患者血清发现#有$个蛋白质峰在两者之间存在显著差异#进一步的纯化和鉴定发现#最高的差异峰!)&是副纤维连接蛋白!(’510%+-5’0%的/端#它是一种在组织中和血清中均表达的多功能蛋白#与细胞黏附%迁移和基质重建均有关&Q’%?’%,#%-对比研究了’#例I//肝癌和(#例乙肝肝硬化患者#发现##个差异蛋白峰有统计学意义#诊断肝癌的敏感性和特异性分别为%&H和)+H#性对A!J#A!J8=$和JEVUA8,更敏感&EMD)存在的问题和前景!近年蛋白质组学研究一直是生命科学研究领域的热点#,7=DE蛋白芯片技术作为临床蛋白质组学研究中理想的技术平台#以其高通量%快速%平行%自动化等优点#为蛋白质组学研究提供了强大的技术支持,#)-&然而#随着研究的深入#,7=DE技术也存在一些问题&G0%2等,#&#!-回顾性分析了实验室内部和实验室之间进行的,7=DE实验#发现实验室内部和实验室之间的重复性不够理想#他们认为#主要原因包括患者选择%血清处理%基线校正%质谱标准化%蛋白芯片选择%噪音差异%软件运算方法及统计方法的不同&因此#在,7=DE技术应用于临床之前#必需经过严格的多中心质控验证#并建立统一的%标准的质谱技术流程和蛋白指纹图谱数据库&,7=DE技术的另一个局限是仅能检测蛋白质分子质量#而不能给出/端%F端序列和蛋白质构型#蛋白质或多肽的进一步鉴定还需要依赖传统方法&蛋白质芯片制备复杂繁琐%检测设备昂贵#也限制了该技术的进一步广泛应用,!#-&综上所述#,7=DE是目前发展最快和应用最广泛和成熟的一种蛋白质芯片技术#随着芯片技术%质谱分析技术及生物信息学的进一步发展#蛋白质芯片技术会越来越成熟#可(%$复旦学报!医学版!!#年(月#$%!$!以更加快速%高灵敏性%高特异性和全自动化地进行蛋白质质谱分析#并成为疾病诊断%治疗及预后判断%寻找药物治疗特异性靶目标的不可或缺的手段#并最后成为药物研究和临床上的常规手段,!!#!$-&,7=DE蛋白技术平台在肝癌研究中的应