丙肝病毒分子分型方法

HCV分子分型方法陈长荣ID:21620101152367丙肝病毒HCV1975年,英国Lancet杂志首次使用非甲非乙型肝炎这个名词1989年,HCVcDNA克隆成功,并正式命名HCV1991年国际病毒命名委员会(ICTV)将HCV归为病毒科丙型肝炎病毒属HCV全球分布情况HCV基因其基因组为单股正链RNA,易变异。全长9.6kb341b的5‘非编码区(5’NTR,NCR,UTR)27b的3’非编码区(3‘NRT)。在病毒复制中,氨基酸有三个蛋白(C、E1、E2/NS1)羧基端有4个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)HCV基因分型分类系统不同的研究者建立并使用各自的HCV分类系统主要的命名系统有:Chan系统、Simmonds系统、Okamoto分类系统、Kanazawa命名系统第二届HCV与相关病毒国际讨论会议上,制定了统一的命名系统--Simmonds系统,目前认为主要有6种HCV基因型及不同亚型,以阿拉伯数字表示HCV基因型,以小写的英文字母表示基因的亚型(如1a、2b、3c等)。HCV基因型分布北美:1,3,2南美:1,2,3欧洲:1,3,2非洲:2,1,3,4,5,6亚洲:2,1,3,4,6中东:4中国：1b，2，6HCV基因分型区域的选择最准确的方法就是对基因组的某个区进行PCR扩增、测序及进化树分析,选择的区有NS5、Core、E1和5‘UTR通常建立在5’UTR,因为该区是HCVRNA诊断实验的常用区域基因分型的分子学方法（1）测序法：测全长或片段金标准费时费力不适于临床（2）基因型特异性引物PCR法Okamoto等首先采用分型的效果仍比较差需使用7对引物OkamotoHetal.JGenVirol.(1992)TypinghepatitisCvirusbypolymerasechainreactionwithtype-specificprimers:applicationtoclinicalsurveysandtracinginfectioussources.(3)型特异性探针杂交(LIPA)将生物素或荧光素标记型特异性探针固化相化在膜或芯片与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交是建立在5’非编码区基础上有5%~10%的1a、1b型不能鉴别,也不能区别2a和2c型。StuyverL，WyseauA，MaertensG，etal.SecondgeneradonlineprobeassayforhepatimCvirusgenotyping[J]jourhalofClinicalMicrobiology，1996；34：2259．HCVgenotypesinNorthernItaly:asurveyof1368histologicallyprovenchronichepatitisCpatients(4)限制性片段长度多态性分析(RFLP)法:用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将PCR扩增的片段切割成不同长度的片段该方法常用的酶为HaeIII、RsaI、MvaI、HinfI、ScrfI该方法检测基因型的精确度为97％不能区分所有的HCV基因亚型也不能识别在泰国和越南发现的变异基因型，DavidsonF,SimmondsP,FergusonJC,etal.SurveyofmajorgenotypesandsubtypesofhepatitisCvirususingRFLPofsequencesamplifiedfromthe5′non-codingregion.JGenVirol,1995,76:1197-1204.(5)遗传发育关系进化树对一定区域的样本测序结束后可将序列互相比较分析样本间序列的进化距离,画出该区域内HCV流行的关系进化树,观察HCV在区域内的分子流行情况及特点（6）特异引物错配延伸法(PSMEA)：利用taq酶在引物3‘末端发生错配时无法继续延伸借助荧光测量仪检出错配峰出现的频率达到分型目的该方法成为检测混合HCV基因型感染的方法．比直接测序灵敏度高20倍AntonishynNA,AstVM,McDonaldRR.etal.RapidgenotypingofhepatitisCvirusbyprimer-specificextensionanalysis[J].ClinMicrobio,l2005,43:5158-5563.（7）异源分子迁移率法（HMA）：用已知不同型的HCV参比DNA与未知基因型的HCV的DNA分子混合、变性、退火,形成同源、异源分子,这些分子在PAGE中迁移率不同,并同异源DNA中不同碱基的数目成比例,来鉴定基因型王林,徐东平,张灵霞.丙型肝炎病毒基因型分型及临床意义[J].肝脏2006,12:416-417.（8）COMA基因分型法：原理是基于长异源双链的解链特性不同．用已知的序列顺序的参考DNA捕获液相中未知的DNA．两者形成异源双链杂交体，由这个杂交体的两条单链间解链曲线的差异可以推断出其序列差异GenotypingHIV-1andHCVstrainsbyacombinatorialDNAmeltingassay(COMA).KostrikisLGetal.MolMed.(1998)（9）Taqman探针实时PCR测试法这一方法用到了Taqman探针(针对5’UTR)结合荧光实时PCRMLindh，HarmounC．GenotypingofhepatitisCvirusbyTaqmanreal—timePCIK．JournalofClinicalVirology，2005；34：108．（10）应用DNA芯片技术指将成千上万种核酸探针固定在一块指甲大小的支持物上通过分析待测样品与芯片的杂交信号可得到大量遗传信息施英娟．基因芯片检测血清标本的丙型肝炎病毒基因型．南通大学学报(医学版)，2005；25(2)：92．谢谢！