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HPLC法测定阿司匹林中游离水杨酸含量戴云坚殷炜铭邵加安陈铁刚背景阿司匹林是一非甾体类解热镇痛、抗炎、抗风湿药物。在其生产过程中乙酰化不完全或储藏过程中水解产生的水杨酸对人体有毒性.因此有必要对阿司匹林中的水杨酸进行限量和含量的测定。《中国药典》一直沿用对照品化学反应目视比色法判断结果，此方法当对照品溶液与供试品溶液颜色相近时易造成判定误差。此次实验设计HPLC法检查阿司匹林中的水杨酸。实验仪器及试药仪器agilent高效液相色谱仪,岛津LC-10A(单泵)高效液相色谱仪；量筒,移液管，容量瓶。试药阿司匹林样品、水杨酸对照品、冰醋酸、无水甲醇、超纯水。实验方法色谱条件色谱柱：C18色谱柱（4.6X150mm）；流动相：1%冰醋酸-甲醇(50：50)(组1),甲醇：水：冰醋酸(8：4：1)(组2)；检测波长：300nm；流速：0.8ml·min-1；柱温：室温溶液的配制水杨酸对照品溶液：水杨酸对照品0．1g100mL量瓶取此液1.0ml100mL量瓶10μg/mol阿司匹林样品溶液：阿司匹林对照品0.1g100mL量瓶1mg/moL组2:冰醋酸：甲醇（1：10）组1:1%冰醋酸-甲醇(50：50)系统适应性水杨酸及阿司匹林的高效液相分离图谱及保留时间的确定:分别取水杨酸对照品溶液、阿司匹林供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。组1组2水杨酸精密度试验按溶液配置中的方法配置水杨酸对照品溶液，从溶液配置到进样，重复6次，计算水杨酸峰积分面积的相对标准差（RSD≤5%）。最低检出限试验(组1)精密吸取水杨酸对照品溶液，用流动相逐级进行稀释。当记录的色谱图中信噪比为10：1时。确定水杨酸的定量限，信噪比为3：1时确定检测限。噪音信号为2.1ng/ml，检测限为6.3ng/ml。进样峰面积峰面积/浓度平均（峰面积/浓度）RSD（%）1801746.880174.6880515.80.382802056.180205.613807673.380767.334804326.780432.675805846.980584.696809299.380929.93进样浓度（μg/ml）峰面积峰面积/浓度平均（峰面积/浓度）RSD（%）19.84352.2593435.8035.3650.8229.89352.2522635.62310.05352.8393235.12410.05352.6987635.09510.07352.6452035.2069.97352.5516435.36组１：水杨酸精密度试验结果表组２：水杨酸精密度试验结果表水杨酸的线性试验配制不同浓度的水杨酸溶液作为标准溶液。各取20μl依次注入液相色谱仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归处理，得水杨酸回归方程。•组１：4、6、10、16、20μg/ml•组２：1.5、3、6、9、15、24、30μg/ml组1图1水杨酸的线性回归图S=7.8801E+07C-1.5760E+04R2=9.9975E-010500000100000015000002000000250000000.0050.010.0150.020.0250.030.035浓度(ug/ml)峰面积组2回收率试验100ml量瓶加入阿司匹林50mg（组１）／100mg(组２）①②③0.5mL浓度为1mg/mL的水杨酸溶液/5.0ml浓度为10ug/mL的水杨酸溶液稀释进样20μl计算平均回收率1.0mL浓度为1mg/mL的水杨酸溶液/15.0ml浓度为10ug/mL的水杨酸溶液1.5mL浓度为1mg/mL的水杨酸溶液/25.0ml浓度为10ug/mL的水杨酸溶液组１：回收率试验结果组别加入阿司匹林量（mg）加入水杨酸量(mg)水杨酸理论总加入量(mg)实际所测水杨酸量(g)回收率(%)149.50.49650.713310.6570092.1251.00.9931.216381.31051107.8349.61.48951.706751.88565110.5组２：回收率试验结果加入阿司匹林量(mg)样品含水杨酸量(mg)加入水杨酸量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)104.70.0937070.050.154245107.33105.471.49108.20.0968390.050.155000105.56101.60.0909320.150.257745106.98104.40.0934380.150.256579105.40104.30.0933490.250.358701104.47103.50.0926330.250.353236103.09稳定性试验配制阿司匹林供试品溶液，分别在0、7、14、21、28、35、42分钟时依法测定。得水杨酸一组峰积分面积，观察峰面积的变化率，得到试验溶液的稳定时间范围。时间（min）0714212835峰面积119.46167.03208.82250.36305.76345.91时间（min）071421283542峰面积205196.2209214.3230418.9250668.4288797.7320371.5351414.4组１：稳定性试验结果表组２：稳定性试验结果表水杨酸峰面积与时间的变化率（竖轴为峰面积，横轴为时间）组1组2水杨酸峰面积与时间的变化率（竖轴为峰面积，横轴为时间）外标法测定阿司匹林中水杨酸含量水杨酸对照品0.1g100mL量瓶精密吸取1.0mL100mL量瓶对照品溶液(10ug/ml)记录色谱图20μL阿司匹林0.1g100mL量瓶滤膜过滤供试品溶液(1mg/ml)20μL记录色谱图组别/峰面积水杨酸平均峰面积样品浓度（mg/ml）水杨酸含量阿司匹林样品13476.530031.0098.809%阿司匹林样品2165.103010.9840.326%组1:外标法测定阿司匹林中水杨酸含量水杨酸对照品10mg100mL量瓶精密吸取3.0mL100mL量瓶对照品溶液(3ug/ml)记录色谱图20μL阿司匹林0.15g50mL量瓶滤膜过滤供试品溶液(3mg/ml)20μL记录色谱图溶液峰面积水杨酸浓度（ug/ml)水杨酸含量12平均值供试品205196.2209214.3207205.32.6850.09%对照品231913.1231125.6231519.43.000组2:１.流动相的选择本实验两个流动相相比较,1%冰醋酸-甲醇(50：50)(组1）理论塔板数与分离度教好，甲醇：水：冰醋酸(8：4：1)(组2)对称性较好，但有杂峰。２.组２所用仪器没有信噪比参数，所以没有确定检测限。３.从分子结构上分析水杨酸中含有羟基和羧酸，而阿司匹林中仅含有一个羧酸且有酯的结构，但从色谱分析中，阿司匹林的保留时间却小于水杨酸的，就其原因可能是因为水杨酸的分子内间氢键大大减小了它的极性所致。讨论４.在做样品的稳定性实验时，发现阿司匹林的稳定性都不好，特别是组1阿司匹林的水解率很大，且随时间变化呈一定的线性关系，原因可能有以下几方面：一是溶液配置过程太长，导致水解发生；二是所配溶剂酸性控制不好，导致了阿司匹林的水解。由实验可知用冰醋酸：甲醇(1：10)(pH值约为2．4）做溶剂相比1%冰醋酸-甲醇(50：50)可一定程度抑制阿司匹林水解．解决方法:一.在实验过程中确定阿司匹林的有效稳定时间，在这段时间内进行水杨酸含量的测定。二.改用其他溶剂,像乙腈一甲酸(99:1)溶液作为本方法测定溶剂.５.检测波长的选择由文献可知，水杨酸对照品溶液在(303±2)、(236±2)nln的波长处有最大吸收，阿司匹林对照品溶液在(276±2)、(226±2)nm的波长处有最大吸收。分别用水杨酸的最大吸收236、302nm的波长作为检定波长，做阿司匹林供试溶液的液相分离色谱，结果显示，用236nm作为检定波长时，水杨酸响应灵敏度高，溶剂、阿司匹林的响应灵敏度更高，得到分离色谱响应因素也多，所得分离色谱不理想；用303nm作为检定波长时，水杨酸响应灵敏度虽有所降低，但溶剂、阿司匹林的响应灵敏度大大降低，得到分离色谱可达到基线分离，响应因素也少，有利于水杨酸的测定。