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第四章中药制剂中各类化学成分分析药物分析教研室第一节生物碱类成分分析生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。生物碱绝大多数具有显著的生物活性,因此中药制剂中有含有生物碱类成分的中药时，常选择该中药含有的生物碱成分作为定性定量的依据。一、生物碱类成分的主要性质及分析特征1、结构特征生物碱大多由C、H、N、O元素组成，极少数分子中尚含有其他元素；大多结构复杂，结构类型较多.结构中的氮原子有多种形式：脂氮、芳氮；季胺、叔胺、仲胺及伯胺；游离状态和与酸结合状态；还有以氮氧配位键形式存在的。此外，结构中除烷烃、羟基取代外还有羧基、酚羟基等酸性官能团及酯键的取代。2、理化性质（1）物理性状多数生物碱为结晶型固体，少数为无定型粉末，还有一些小分子生物碱为液体，例如槟榔碱、菸碱等；液体状的生物碱及个别小分子生物碱尚有挥发性甚至升华性，如麻黄碱具有挥发性、咖啡因具有升华性等。一般生物碱为无色或白色，但结构中具有较长共轭体系，并有助色团的，可显不同颜色。生物碱结构中如有手性碳原子或为手性分子的具有旋光性，并大多与生物碱的生理活性有关，通常左旋体比右旋体生理活性强。（2）溶解性由于生物碱结构复杂，生物碱的溶解性也是多样化。大多数生物碱成分极性较小，游离状态下难溶于水，易溶氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂，与酸结合生成生物碱盐后水溶性增加，但与生物碱结合的酸不同，生成的盐水溶性也有差异，一般含氧无机酸及小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大。季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水，液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂。含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液。（3）沉淀反应大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物，这些试剂称生物碱沉淀试剂。生物碱的沉淀试剂根据其组成有碘化物复盐、重金属盐和大分子酸三大类。生物碱的沉淀反应可以检查中药制剂中生物碱的存在，当某些沉淀试剂与生物碱生成的沉淀组成恒定时，还可以用于中药制剂中生物碱成分的含量测定。（4）显色反应生物碱与一些浓无机酸为主的试剂反应产生不同的颜色，这些呈色反应多用于检识和区别纯品生物碱，而较少用于中药制剂中生物碱成分的分析。生物碱在一定pH条件下可与一些酸性染料（多为磺酸肽类）生成有色络合物，可被氯仿等有机溶剂定量提出.还有些结构中具有酯键的酯碱如乌头碱等可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色，这些特点可用于中药制剂中生物碱成分的分析。（5）碱性大多数生物碱呈碱性反应，能使红色石蕊试纸变蓝。生物碱之所以能显碱性，是因为它们分子中氮原子上的孤电子对对质子有一定程度的亲和力，因而表现出碱性。（6）紫外光谱特征结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收，其中包括结构母核即为共轭体系的和只有部分结构为共轭系统的。紫外光谱的吸收峰位置除与其他化合物一样与共轭系统中助色团的种类、位置、数量有关外，需要特别指出的是，结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱，其吸收峰位置还与测定时溶剂的pH有关。二、生物碱类成分分析方法1、单体生物碱分析（1）定性鉴别沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法，主要利用生物碱能与一些试剂生成沉淀这一特性。此反应一般在酸性水溶液中进行。（2）单体生物碱的含量测定①薄层色谱法此法简便、快捷。选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别严格，但比鉴别严格。②高效液相色谱法可用液-液分配色谱法、液-固吸附色谱法以及离子交换色谱法。③气相色谱法2、中药中生物碱分析（1）总碱分析①定性鉴别由于中药制剂中成分复杂，有些成分如蛋白质、多肽和鞣质等也可与试剂生成沉淀而造成假阳性结果，因此，制备样品供试液时必须净化处理，除去干扰成分，方能用沉淀反应进行中药制剂中生物碱类成分的鉴别.②总生物碱的含量测定化学分析法化学分析法包括重量分析法和容量分析法。目前主要使用酸碱滴定法。强碱滴定生物碱盐时,在70%-90%的乙醇介质中终点比在水中明显,因此常将生物碱盐溶于90%乙醇,再用标准碱乙醇液滴定.酸碱滴定法指示反应终点可用指示剂和各种电位法。分光光度法目前多用单波长光度法，测定波长可选用待测生物碱成分本身的吸收波长，也可加入某些试剂如亚硝酸钠试剂、雷氏盐试剂及酸性染料等反应显色后用可见光波测定。常用方法：直接测定、离子对萃取比色法直接测定不经过化学反应,利用生物碱物质自身的光吸收直接进行比色测定的方法;一般用于药味较少、干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定;离子对萃取比色法酸性染料比色法应用本法的关键在于介质的pH、酸性染料的种类和有机溶剂的选择;常用的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚兰（BTB）和溴甲酚绿等；PH的选择要根据染料的性质及生物碱的碱性(pKa)大小来确定;选择有机溶剂的原则是根据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱而定.氯仿、二氯甲烷与离子对形成氢键,有中等程度的提取率,且选择性也较好,故是常用的提取溶剂.高效液相色谱法以反相高效液相色谱应用较多。在反相高效液相色谱中,由于硅胶表面残留硅醇基的影响,使生物碱分析易产生保留时间延长、峰形变宽、拖尾.可采取改进流动相、固定相等措施以克服游离硅醇基的影响,满足定量定量分析的要求.中药制剂中生物碱成分时行高效液相色谱法测定时,使用较多的是紫外检测器.气相色谱法只适用于有挥发性的、遇热不分解的生物碱类;生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色谱柱和检测器不利,应该注意;制备供试品溶液时一般应采用冷提取,净化过程也要避免加热,以防成分流失,最后需用氯仿等低极性有机溶剂为溶媒制备成供试液.（2）各生物碱组分分析根据总生物碱中各生物碱的性质差异，如碱性差异、极性差异。通常采用色谱法对每种生物碱进行分离后分析3、应用示例戊已丸中生物碱的含量测定处方组成：黄连、吴茱萸（制）、白芍（炒）。取本品粉末（过三号筛）0.7-0.9g，精密称定，置索氏提取器中，加盐酸-甲醇（1：100）适量，加热回流至提取液无色，提取液浓缩后移至25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置氧化铝柱（内径约0.9cm，中性氧化铝5g，湿法装柱，用乙醇30ml预洗）上，用乙醇35ml洗脱。收集洗脱液，置50ml量瓶中，加乙醇稀释到刻度，摇匀，照分光光度法，在345nm处测定吸收度，按盐酸小糪碱的吸收系数728计算，即得。本品按干燥品计算，每1g含生物碱以盐酸小糪碱(C20H18ClNO4)计，不得少于30mg。第二节蒽醌类成分分析一、概述中药中醌类化合物主要有苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌四种类型。其中以蒽醌类化合物最为多见，包括蒽醌及其不同还原程度的产物和二聚物，如蒽酚、氧化蒽酚、蒽酮、二蒽酮、二蒽醌等。这些化合物在中药中可游离存在，也可与糖结合成苷，称为蒽苷。二、结构特征及理化性质1、结构类型及特征苯醌类苯醌类化合物从结构上可分为邻苯醌及对苯醌两大类。因前者不稳定，故天然存在的苯醌化合物多为对苯醌的衍生物，且在醌核上多有-OH、-OCH3、-CH3等基团或更长的烃类侧链。OO123456OO123456对苯醌邻苯醌萘醌类萘醌化合物从结构上考虑可以有α(1,4)、β(1,2)及amphi(2,6)三种类型。但迄今为止从自然界得到的几乎均为α-萘醌类。OO12345678910OO12345678910OOα-（1，4）萘醌β-（1，2）萘醌amphi-(2,6)萘醌菲醌类天然菲醌衍生物包括邻醌（A）及对醌（B）两种类型。21OORROOOHRO（A）（B）蒽醌类蒽醌类成分包括蒽醌衍生物及其不同还原程度的产物，如氧化蒽酚、蒽酚、蒽酮及蒽酮的二聚物等。OO123456784a9a8a10a910OO[H][O]OOH[H][O]OOH蒽醌氧化蒽酚蒽酮蒽酚2、理化性质（1）溶解性苯醌及萘醌多以游离状态存在；而蒽醌类则往往结合成苷存在于植物体中；游离的醌类多具有升华性；小分子的苯醌及萘醌类具有挥发性，能随水蒸气蒸馏，可据此进行提取、精制工作。游离醌类多溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿等有机溶剂，微溶于或不溶于水。结合成苷后极性增大，易溶于甲醇、乙醇中，在热水中也可溶解，几乎不溶于乙醚、苯、氯仿等非极性溶剂中。（2）酸碱性蒽醌类化合物分子中多具有酚羟基，故具有一定酸性，在碱性水溶液中易溶，但加酸酸化时又可重新沉淀析出，所谓碱提取—酸沉淀即是根据这个道理进行的。根据以上性质，醌类化合物的提取可采用碱提取-酸沉淀法。（3）显色反应醌类的颜色反应主要取决于其氧化还原性质以及存在的酚羟基的性质。碱性条件下的呈色反应：羟基蒽醌类在碱性溶液中会引起颜色改变并加深。与金属离子的反应：在蒽醌类化合物结构中，如果有α-酚羟基或具有邻位二酚羟基时，则可与Pb2+、Mg2+等金属离子形成络合物。与Pb2+形成的络合物在一定pH条件下能沉淀析出，故可用于该化合物的精制。与对亚硝基二甲基苯胺反应：9位或10位未取代的羟基蒽酮类化合物，尤其是1，8-二羟基衍生物，酮基对位的亚甲基上的氢很活泼，可与对亚硝基二甲基苯胺反应，缩合产生各种颜色。三、定性鉴别1、显色反应将中药制剂用适当方法提取分离，制成供试品液，利用碱性条件下的呈色反应或醋酸镁显色反应等可对羟基蒽醌类成分进行鉴别。2、升华法游离的蒽醌及其他醌类衍生物多具有升华性。中药制剂中如含有这类成分量较大，可采用升华法得到升华物，可见光下观察或加碱性试液显色定性。如大黄流浸膏的鉴别。3、薄层鉴别（1）吸附剂：多用硅胶（2）展开剂：A：乙酸乙酯-甲醇-水（100：16.5：13.5或相近的比例），适于他离蒽醌苷元和蒽醌苷。B：正丙醇-乙酸乙酯-水（4：4：3）和异丙醇-乙酸乙酯-水（9：9：4），适于分离番泻苷和二蒽酮苷C：不含水或甲醇的混合溶媒适合于他离蒽醌类的苷元。（3）显色方法：主要有喷碱性试剂或醋酸镁甲醇液、氨气熏及在紫外灯下观察荧光，亦可在可见光下直接观察色斑。四、含量测定蒽醌类成分含量测定1、游离蒽醌的测定中药中含有游离蒽醌的量一般不高，且为脂溶性的，故此部分另用弱极性溶剂如乙醚、氯仿等提取后加碱比色测定。2、结合蒽醌的测定通常是取游离蒽醌测定项下的药渣将苷提出，水解成苷元后再测定；将药渣先行酸水解，然后用非极性溶剂提取苷元后测定；取待测样品先行酸水解，然后用非极性溶剂提取苷元后测定，其结果为总蒽醌含量，从中减去游离蒽醌含量，即得结合蒽醌的含量。3、蒽醌类单体成分的测定中药制剂中蒽醌类单体成分的测定一般要将样品水解后再进行测定，测定方法主要有薄层扫描法和高效液相色谱法。薄层扫描法为蒽醌类成分常用定量分析方法，经层析分离后，可在可见光、紫外光及荧光下扫描测定。蒽醌类成分在紫外及可见光下均有强吸收，利用高效液相色谱-紫外可见光检测器测定蒽醌类单体成分，具有灵敏、准确、简便等特点。在含蒽醌类化合物的中药制剂分析中应用日趋增多。第三节黄酮类成分分析一、概述黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于自然界的一大类化合物。多具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。黄酮类化合物最集中的是被子植物，类型最全，结构最复杂，含量也高。由这些中药参与配伍的中药制剂也较多见。二、结构特征及理化性质1、结构特征黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物，现在则是泛指两苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。根据基本结构又可分为黄酮、黄酮醇、双黄酮、异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、橙酮、花青素、黄烷等类型。多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故在200-400nm波长区域内有强烈的吸收带，此是光谱法及色谱—光谱法分析的基础。大多黄酮及其苷类含有游离酚羟基，可与聚酰胺形成氢键，可用聚酰胺色谱法进行分析。2、理化性质（1）物理性状黄酮类化合物多为晶性固体，少数（如黄酮苷）为无定形粉末。游离的苷元中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、