Illumina光纤微珠芯片技术

IlluminaBeadArray®Technology&ApplicationIllumina光纤微珠芯片技术及应用邱亚静2019年8月基因芯片的基本原理基因芯片又称DNA微阵列（microarray），把大量已知序列探针集成在一个基片上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来检测信息2019年8月*****基因芯片的制作•点样法•原位合成2019年8月基因芯片制备原位合成法，原位合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。原位合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。点样法。基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头,分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。2019年8月PeterJ.Russell,iGenetics:Copyright©PearsonEducation,Inc.,publishingasBenjaminCummings.原位合成2019年8月PeterJ.Russell,iGenetics:Copyright©PearsonEducation,Inc.,publishingasBenjaminCummings.2019年8月PeterJ.Russell,iGenetics:Copyright©PearsonEducation,Inc.,publishingasBenjaminCummings.2019年8月原位合成技术•可达很高的密度•合成过程中大量不完全片断残留在基片上•探针序列不能太长，一般为25bp2019年8月点样法2019年8月2019年8月2019年8月点样技术片断长度不受限制需要预先准备大量的核苷酸点的大小，间距较难控制2019年8月新一代芯片技术光纤微珠芯片ScreeningUnlabeledDNATargetswithRandomlyOrderedFiber-OpticGeneArrays,Steemers,F.J.,Ferguson,J.A.,Walt,D.R.,NatureBiotechnology,18,91-94,2000.Techview:MolecularBiology.Bead-BasedFiber-OpticArrays,Walt,D.R.,Science,287,451-452,2000DecodingRandomlyOrderedDNAArrays,KevinL.Gunderson,GenomeResearch,14:870-877,2004.2019年8月1.微珠3.1um无孔无荧光硅珠每个微珠单独质控光纤微珠芯片---技术原理•有效的反应表面积和体积比•低/无背景•大小均一2019年8月Oligator®合成工厂2.寡聚核苷酸探针光纤微珠芯片---技术原理96孔板全自动化合成LIMS控制所有过程年生产能力20million(20-mer)严格的QC系统OD260检测产量MALDI-TOF质谱检测UV毛细管电泳实时数码色彩监控2019年8月2.寡聚核苷酸探针3’End5’End50mer探针合成探针23mer地址序列光纤微珠芯片---技术原理73mer3’5’合成方向2019年8月23mer50mer探针3’End5’End探针与微珠连接光纤微珠芯片---技术原理2.寡聚核苷酸探针每个微珠上连接100万左右相同的探针2019年8月KeyTechnologyElements:BeadChemistryHowdowemakeourBeads?Athreestepprocess!RawBeadsSilanization–producesageneralcouplingmolecule–anamineTrimethoxyaminopropylsilaneVerystablecomparedtoothertechniquesActivationPreparesthebeadtoattachtheOligoCyanuricChlorideImmobilizationofDNAComplexityDiscretereactions96WellmicrotiterplateNH2OHNNNNHClCl2019年8月每种(微珠+探针)单独合成并QC不同种微珠混合在一起形成微珠池(1624－24,000+种微珠)2.寡聚核苷酸探针光纤微珠芯片---技术原理•高杂交特异性•全长序列探针•定制灵活•100%质量检控QC2019年8月KeyTechnologyElements:BeadProductionSynthesisofOligosActivatedBeadPlates+OligoPlatesGilson96TipRobotOvenPooledBeadSetQC2019年8月acidetchstrandcladdingstrandcorephoto-resistsiliconwaferplasmaetchingcleaningOpticalfiber3µmbeadsinwells3.芯片的组装光纤微珠芯片---技术原理2019年8月KeyElements:RandomBeadAssemblyMixtureofDifferentBeadTypes6x2WholeGenomeBeadChipBeadPoolispipettedontheSubstrateNoInformationofBeadIdentityandlocationonArray2019年8月•将微珠池内微珠倒入蚀刻光纤，微珠无序自组装进入小孔，每根光纤上带一个微珠•每种微珠大约有~30个重复3.芯片的组装光纤微珠芯片---技术原理•消除系统随机误差•高重复性•微珠之间间距均一2019年8月光纤束-微珠3.芯片的组装光纤微珠芯片---技术原理传统芯片图DecoderOligo12345678910111213141516Decodehyb1Decodehyb2Decoderhybridization1Decoderhybridization22019年8月4.芯片解码光纤微珠芯片---技术原理Gundersonetal.(2004)DecodingrandomlyorderedDNAarrays.GenomeResearch14,870-877.4.芯片解码光纤微珠芯片---技术原理2019年8月KeyElements:DecodingStrategyExpandsExponentially指数级解码XY=totalnumberofcodesX=totalnumberofcolorsorstatesY=totalnumberofhybridizationstagesSingleIllumiCodeStrategyExample:38=6,56148=65,53624merICode2019年8月每张芯片上每个微珠每个特性都被质控(100%QC)位置和强度控制有多少重复小部分不合格地被捡出是Illumina出厂前的生产步骤每个芯片在出厂前已通过解码和质控解码CD随芯片送至用户处4.芯片解码光纤微珠芯片---技术原理2019年8月KeyElements:DecodingQualityMetrics%ofBeadsLoaded:~98%%ofBeadsDecoded:~98%BeadTypeRepresentation:~30ErrorRate:0.05%PresenceofallBeadTypesDecodingIntensitiesofeachstageFocusMetricsAllparametersmonitoredin~realtime2019年8月KeyElements:DecodingQualityMetrics2019年8月BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-12019年8月BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1GoldenGateTMGenotypingandDASLTM“UniversalArray”2019年8月BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1FocusedGEXSets(StandardSamplers,CustomBeadPools)2019年8月BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1WholeGenomeGeneExpression2019年8月BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16InfiniumInfiniumTMWholeGenomeGenotyping2019年8月BeadStation®扫描系统激光共聚焦扫描系统高分辨率,0.8micron双色激光at532&635nm光纤微珠芯片---技术原理•超高分辨率•全自动化定位,扫描2019年8月BeadArrayReaderConfocallaserscanningsystemSub-micron,0.8micronTwolasers532,635nmSupportsCy3&Cy5imagingAuto-focusing,centeringandtiltingwithoutphotobleachingSupportsgenotyping,geneexpressionapplicationsScansbothArrayMatrixandBeadChipmicroarrays2019年8月SentrixBeadChip:AnalyticalFluorescentImage2019年8月UserSuppliedDual-block96-wellthermalcyclerw/heatedlid2platecentrifuges(preandpost-PCR)pipetteIllumina提供BeadArrayReaderPCHybridizationchamberRaisedbarmagnetHeatblocksOvencapableof45/70oCPlatevortexUserdocumentationBeadStudiosoftwareInstallation&trainingIllumina’sBeadStation500System2019年8月灵活性扩展性重复性均一性？？？特点