7 第十八章 高效液相色谱法

1仪器分析黄红霞第十八章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography,HPLCHPLC定义：经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术高压输送流动相高效固定相高灵敏度检测器现代液相色谱分析法——分离分析优点—与经典液相色谱法相比颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。优点—与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。第一节高效液相色谱法的主要类型和原理一、主要类型按固定相的聚集状态：LSC,LLC按分离机制：分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法常用的色谱类型化学键合相色谱法离子抑制色谱法离子对色谱法其他色谱类型-亲合色谱法-手性色谱法-胶束色谱法-电色谱法二、化学键合相色谱法（BPC）以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相优点：固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）键合相色谱法：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱（一）正相键合相色谱法固定相：极性键合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）流动相：非/弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物如一些在硅胶柱上分离的物质正相键合相色谱法分离机制？分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解?吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用?保留行为：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。（二）反相键合相色谱法固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂常用甲醇－水、乙腈－水等应用：最广非极性至中等极性的组分（还有有机酸、碱及盐等）保留机制疏溶剂溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力。反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素1、溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。2、固定相键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素3、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大中性盐的加入：使中性溶质的k增大pH：影响弱酸、弱减的离解流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。离子抑制色谱法（ISC）用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱反相键合相色谱法把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。（三）反相离子对色谱法反相离子对色谱法离子对模型33++()+3s3(+固定相+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH离子对mB+ABAmA(smBAmmmsmsBAA][A][B]AB[]B[]A[BEK流动相通式影响保留行为的因素离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大固定相、流动相性质（同一般RP-HPLC）。适用范围和离子对试剂的选择适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等。分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）。第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。一、化学键合相色谱法的固定相（一）键合相的种类非极性键合相：非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。键合相的种类弱极性键合相：醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱极性键合相：常用氨基﹑氰基键合相（氰乙硅烷≡Si(CH2)2CN)键合硅胶一般用于正相色谱特殊用途的键合相（二）键合相的性质和特点键合反应硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应22SiOHClCH+SiSiSiClH18OR118HC3737RRR1如：YWG－C18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基；SpherisorbODS，球形硅胶Spherisorb上键合了ODS。键合相的性质和特点键合相的性质含碳量：含碳的百分数覆盖度：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。键合相的特点使用过程中不流失；化学稳定性好；适于梯度洗脱；载样量大注意流动相的pH一般应在2-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH范围的键合相)。键合相的性质和特点二、化学键合相色谱法的流动相对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内，与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱压，提高柱效。（一）流动相对分离的影响n由色谱柱（固定相）性能决定，α主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。2211-4nkkααR（二）流动相的强度和选择性溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强溶剂的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同混合溶剂（二元或多元流动相）三、分离条件的选择（一）HPLC中的速率理论涡流扩散A=2λdp球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。纵向扩散B=2γDm可以忽略。因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳HPLC中的速率理论传质阻抗固定相传质阻抗CS可以忽略，因df极小;流动相传质阻抗Cm要求：dp小，Dm大m2PmmDdC静态流动相传质阻抗：•由于部分流动相在固定相微孔内的滞留•静态流动相传质阻抗系数Csm•Csm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η•要求:固定相dp2、流动相η都小HPLC中的速率理论H=A+Cmu+Csmu原因：化学键合相，液体流动相HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。HPLC中的速率理论（二）正相键合相色谱法的分离条件固定相极性键合相如氰基、氨基键合相等流动相烷烃加适量极性调节剂（三）反相键合相色谱法的分离条件固定相非极性键合相如ODS流动相以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂加入0.1%~1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用（四）反相离子对色谱法的分离条件固定相尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相，离子对试剂离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反流动相pH使试样组分与离子对试剂全部离子化有机溶剂及其浓度同一般HPLC第三节高效液相色谱仪组成输液系统进样系统色谱柱系统检测系统数据记录处理系统一、输液系统高压输液泵恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量范围宽能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好，耐腐蚀输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气二、分离和进样系统进样器进样阀（六通阀）、自动进样装置色谱柱由柱管和固定相组成分析柱、制备柱性能评价H、n、fs、k和α的重复性，或R。三、检测系统（一）检测器的主要性能要求：灵敏度（sensitivity）高（检测限低）噪音（noise）低线性范围（linearrange）宽重复性（repeatability）好适用范围广（通用型、专属型）（二）紫外检测器检测原理：朗伯－比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl特点：灵敏度较高（10-6～10-9g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。专属型、浓度型检测器紫外（UV）检测器固定波长检测器：254nm可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），200～400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似光电二极管阵列检测器(PDAD)：一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光紫外(UV)检测器光电二极管阵列检测器工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱－色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。紫外检测器（三）荧光检测器(FD)检测原理：化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光；荧光强度(F)与激发光强度(I0)及荧光物质浓度(C)之间的关系为：F=2.3QKI0εClQ为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系数，l为光径长度。F=KC荧光检测器(FD)特点：选择性好，专属型检测器灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10g/ml）激发波长(ex)和发射波长(em)的选择第四节高效液相色谱分析方法定性分析方法定量分析方法：外标法、内标法(同GC)主要内容化学键合相色谱法的原理：反相键合相色谱法反相离子对色谱法正相键合相色谱法化学键合相色谱法的固定相、流动相化学键合相色谱法的分离条件高效液相色谱中的速率理论定量分析方法紫外、荧光检测器主要内容