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2007,Vol.28,No.07食品科学※生物工程324收稿日期：2007-06-25基金项目：国家高技术研究计划“863”重点资助项目(2006AA10A208)作者简介：于雅琼(1982-)，女，硕士研究生，主要从事土壤生物修复与环境微生物学的研究。于雅琼1,2，陈红艳2，李平兰3，周伟3(1.中国农业大学资源与环境学院，北京100094；2.山西农业大学资源与环境学院，山西太谷030801；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)：为了给农业生产(发酵饲料、堆肥、污水处理)及微生态调节剂的制备提供前期理论依据和优良的微生物资源，本研究以土壤、饲料和肥料为材料，分离筛选出22株优良的芽孢杆菌菌株，按《伯杰氏细菌学鉴定手册》和芽孢杆菌特有的生理生化指标对其进行了初步鉴定，结果显示，其中的T-1为多粘类芽孢杆菌(Bacilluspaenibacilluspolymyxa)；T-2为桥石短芽孢杆菌(Bacilluschoshinensis)；T-6为软骨酸类芽孢杆菌(Bacilluspaenibacilluschondroitinus)；T-8为解淀粉类芽孢杆菌(Bacilluspaenibacillusamyloyticus)；S-4为饲料类芽孢杆菌(Bacilluspaenibacilluspabuli)；S-6为哥本类芽孢杆菌(Bacilluspaenibacilluskobensis)。其余的16株芽孢杆菌还有待于进一步鉴定。在此基础上，采用纸片琼脂扩散法测定了已鉴定出的6株芽孢杆菌对常用的12大类35种抗生素的药敏性。结果显示，分离自土壤、饲料及堆肥中的芽孢杆菌均对喹诺酮类、氨基糖甙类、大环内酯类和糖肽类抗菌素表现出敏感性，大部分对多肽类抗菌素表现出耐受性，其他抗菌素则在不同芽孢杆菌菌株间表现出差异性。：芽孢杆菌；分离；鉴定；药敏性检测Isolation,IdentificationandAntibioticSusceptibilityofBacillusfromDifferentStuffsYUYa-qiong1,2，CHENHong-yan2，LIPing-lan3，ZHOUWei3(1.CollegeofResourcesandEnvironment,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China；2.CollegeofResourcesandEnvironment,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China；3.CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)Abstract：Forthepurposeofprovidinginformationandscreeningmicroorganismforagricultureproductionandmicroecologicsproduction,22strainsBacillusisolatedfromsoil,feedstuffandorganicfertilizerwereidentifitedaccordingtothehandbookofBergesbacteriologyidentificationandtheirphysiologicandbiochemicaltest.Theresultdemonstratethat,T-2,T-6,T-8,S-6,S-4,T-1wereBacilluschoshinensis,Bacilluspaenibacilluschondroitinus,Bacilluspaenibacillusamyloyticus,Bacilluspaenibacilluskobensis,Bacilluspaenibacilluspabuli,Bacilluspaenibacilluspolymyxa,respectively.Therest16strainsBacillusareonthestudy.Onthebasis,antibioticsusceptibilityofthesixBacillusstrainsweredetectedto35antibioticsof12groupsbytheagardiffusiontest.Theresultsdemonstratedthat,allstrainsexaminedweresentivetoquinolinegroup,aminoglycosidegroup,macrolidegroupandpeptidegroup,andresistanttosulphonamidegroup,whileshowingdifferentantibioticsusceptibilitytotheotherantibiotics.Keywords：Bacillus；isolation；identification；antibioticsusceptibilitytesting中图分类号：Q939.11文献标识码：A文章编号：1002-6630(2007)07-0324-07我国对益生菌制剂的研究开始于20世纪70年代，根据对微生物的定性、定量和定位测定结果分析，提出了自然界微生态比例失调的新观点，在此微生态失调理论的指导下研制微生态调节剂，在实际应用中表现出显著的作用效果和潜在的应用前景。农业生产中的肥料、饲料及环境保护中常用的微生物活菌制剂包括有多种微生物，其中芽孢杆菌由于其好氧，营养要求粗放，生活能力强，且能够分泌蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等多种微生物酶而在实际生产中得到了广泛的应用。芽孢杆菌可降解甘油三酯、蛋白质、淀325※生物工程食品科学2007,Vol.28,No.07粉、木聚糖、果胶等高分子物质，尤其对植物性碳水化合物具有较强的降解能力[1]。芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞成直杆状，常以成对或链式排列，具圆端或方端，芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境[2]。通常每个细胞产生一个芽孢，生孢不被氧所抑制，属于化能异养菌，好氧或兼性厌氧，具发酵或呼吸代谢类型。芽孢杆菌在自然界中分布非常广泛，土壤、空气、肥料、饲料、食物等生境中都有存在，甚至在沙漠沙土、海洋沉淀物等较为恶劣环境中也有存在[3]。与其他微生物活菌制剂相比，芽孢杆菌具有在条件不利的环境下形成芽孢将自己保护起来的特点，且复活率高。同时还具有耐酸、耐盐、耐高温(100℃)及耐积压等优点，因此在饲料、肥料的生产中具有较高的稳定性[1]。目前在肥料、饲料工业及环保中应用的主要有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)等，在使用时多制成休眠状态的活菌制剂或与乳酸菌混合使用[4]。近年来的研究还发现，有益的芽孢杆菌能促进机体免疫器官及组织的成熟，使这些器官、组织处于高度准备状态，可促进T、B-淋巴细胞的数量增加，从而提高机体的体液免疫和细胞免疫水平，因此，芽孢杆菌在动物和人体的微生态调节中也得到了高度的重视和广泛的应用[1]。本研究以土壤、饲料和肥料为材料，分离筛选优良的芽孢杆菌菌株并对其进行初步的鉴定，以此来大致了解不同自然生境中芽孢杆菌的菌相构成。在此基础上，采用纸片琼脂扩散法检测其对临床常用抗生素的敏感性，可望研究结果能为农业生产(发酵饲料、堆肥、污水处理)及微生态调节剂的制备提供前期理论依据和优良的微生物资源。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种分离材料分别取中国农业大学科学园菜园采集的表层土样，中国农业大学国家饲料工程技术中心提供的饲料，中国农业科学院土肥所提供的肥料，作为分离芽孢杆菌的材料。1.1.2分离培养基[5]LB培养基用于芽孢杆菌的分离，具体培养基配方如下：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，定容至1L，调节pH为7.0，121℃20min灭菌。若是固体培养基可添加1.5%的琼脂。1.1.3化学试剂及溶液蛋白胨、牛肉膏、乙醇、琼脂、氯化钠、香柏油、二甲苯、葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、明胶、淀粉、柠檬酸盐、苯丙氨酸脱氨酶、硝酸盐等。0.85%无菌生理盐水；革兰氏染液一套；孔雀绿石炭酸染色液一套。1.1.4质控菌金黄色葡萄球菌25923(StaphylococcusaureusATCC25923)中国药品生物制品检定所。1.1.5药敏纸片购自中国药品生物制品检定所，共12大类35种抗生素，具体见表1。抗菌药物类型抗菌药物名称青霉素类氨苄青霉素(氨苄西林)、苯唑青霉素、优立新(氨苄西林/舒巴坦)头孢类头孢呋新、头孢曲松、头孢噻亏、头孢羟氨苄、头孢克洛喹诺酮类氧氟沙星、左氧沙星、洛美沙星氨基糖甙类丁胺卡那霉素(阿米卡星)、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素多肽类杆菌肽、多粘菌素B磺胺类磺胺甲基异恶唑(磺胺)、复方新诺明大环内酯类红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、麦迪霉素四环素类四环素、多西环素、米诺环素呋喃类呋喃妥因、痢特灵糖肽类万古霉素、替考拉宁其他类氯霉素、利福平、克林霉素、磷霉素表1实验用12类35种抗生素Table135kindsofantibioticsinthestudy1.1.6设备与器材超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、电热恒温培养箱、WH-3微型旋涡混合、电热鼓风干燥箱、电子万用炉、光学显微镜、数码显微照相机、香柏油。试管、培养皿、接种环、加样枪、记号笔、载玻片等。1.2方法1.2.1芽孢菌的分离培养分别取25g样品，破碎后放入225ml无菌生理盐水中，振荡均匀。70℃加热15min以去除部分微生物。然后用加样器从加热处理后的菌悬液中吸1ml到9ml的无菌生理盐水中，振荡均匀后依次做10倍系列稀释到10－8，取不同稀释度的菌液各1ml入灭菌的培养皿，而后倾注融化并冷却到45～50℃的LB培养基，迅速水平转动培养皿混合均匀，而后置于37℃恒温培养箱中培养24～2007,Vol.28,No.07食品科学※生物工程32648h后挑取可疑单菌落。1.2.2分离菌种的初步鉴定[6-7]根据《伯杰氏细菌学鉴定手册》中的形态学和生理生化指标及有关芽孢杆菌的特点，对分离出的菌株进行鉴定。具体指标包括：(1)革兰氏染色实验；(2)接触酶；(3)糖醇发酵试验：主要包括葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、明胶、淀粉、柠檬酸盐、苯丙氨酸脱氨酶、硝酸盐)；(4)葡糖酸盐产气试验；(5)精氨酸产氨试验；(6)葡萄糖产酸、产气试验。1.2.3菌种的药敏性检测1.2.3.1菌液的制备取少量试验菌接种于液体LB培养基中37℃培养24h，菌液用于药敏试验用。1.2.3.2培养基的制备按培养基配方称量各成分放于烧杯中，加蒸馏水并搅匀，边搅拌边加热至溶解，调节pH值到所需范围，液体培养基用滤纸过滤，固体培养基用多层纱布过滤，而后112℃15min灭菌。1.2.3.3药敏试验[8]取浓度为(1.5～3.0)×108CFU/ml的菌液1ml于灭菌的培养皿中，加入12～15ml融化并冷却到45～50℃的LB培养基，迅速水平转动培养皿，待培养基凝固后贴放标准药物纸片后放于4℃下扩散5h，而后置37℃下培养24h后测量并记录抑菌圈直径。1.2.3.4敏感或耐药的判断标准[9]用标准敏感菌株StaphylococcusaureusATCC25923作为质控菌，试验菌株对35种抗生素的药敏性参照WHO提供的NCCLS昀新版本的标准进行。将游标卡尺测得的抑菌圈直径与标准相比较，试验结果包括敏感(S)、中介(M)、耐药(R)三种。2结果与分析2.1不同生境中芽孢杆菌的鉴定结果2.1.1菌落形态特征经分离后在固体琼脂培养基上长出了不同特征的单菌落，其菌落形态和颜色有所差异。有表面光滑的，有表面萎缩的，有周边圆润的，有周边呈不规则形状的。从中挑取可疑的单菌落，其典