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猪呼吸道疾病综合征基因芯片诊断方法的建立与应用高淑霞2,4吴时友1尹燕博1庄文忠3牛钟相2(1.山东澳兰生物工程研究院,山东青岛261001;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018;3.山东省农业厅,山东济南250013;4.山东省农业科学院山东济南250100)摘要：根据Genbank发表的核酸序列，分别设计合成流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病病毒的特异引物,应用PCR（或RT-PCR）分别扩增各病毒的特异片断，并克隆到pMD18-TSimpleVector构建重组质粒，用于各病毒探针的制备。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上，制备成低密度基因芯片。在多重PCR过程中，用生物素标记的dUTP(Bio-11-dUTP)对待检样品进行标记，扩增产物与基因芯片杂交，最后用扫描仪进行读片和分析。对临床疑似病例检测结果表明，该方法可以同时检测待检样品中4种病毒的存在情况，与PCR方法相比，显示了较高的灵敏度。该方法的建立，为批量样品的检测和猪呼吸道疾病综合征流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。关键词：呼吸道疾病综合征；基因芯片；多重PCR；核酸杂交LowDensityDNAarrayforDiagnosingPorcineRespiratoryDiseaseComplexGAOShuxia2,4,WUShiyou1,YINYanbo1,ZHUANGWenzhong3,NIUZhongxiang2(1ShandongOlandInstituteofBioengineering,Qingdao261001;2CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgricultureUniversity,Tai’an2710183.ShandongAgricultureoffice,Jinan250013;4ShandongAcademyofAgricultureScience,250100)Abstract：BasedonthepublishednucleotidesequencesofInfluenzaAvirus,Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,Porcinecirocovirus-2andPorcinepseudorabiesvirus,4pairsofprimersweredesigned.AndconservedDNA(orcDNA)fragmentsofthe4virusesobtainedbyusingPCR(orRT-PCR),wereligatedwithpMD18-TSimpleVectortoconstructrecombinantplasmidforDNAprobepreparation.TherecoveredDNAprobeswerespottedonlocatedsitesonnitrocellulosefiltertopreparelowdensityDNAarray.DuringtheprocessofmultiplexPCR,sampleswerelabeledbyBiotin-11-dUTP.ThenthelabeledPCRproductswerehybridizedwithDNAarrays,andthehybridizationsignalswerescannedandanalyzedbyscanningdeviceandsoftware.TheresultsshowedthatthisDNAarraycouldidentifyanddistinguishthe4virusesinsamplessynchronouslyandwasmoresensitivethanPCRmethod.Thismethodcanbeuseforlabdiagnosis,epidemiologyinvestigationandquarantineofanimalandanimalproductsinalarge-scale.Keywords：Porcinerespiratorydiseasecomplex;DNAarray;multiplePCR;nucleotidehybridization*correspondingauthor：Email：猪呼吸道疾病综合征（porcinerespiratorydiseasecomplex,PRDC）是九十年代中期在北美提出的，用来描述当时出现的一种呼吸道疾病，主要症状是：咳嗽和呼吸困难，并伴有采食量下降、生长停滞，常发生在肥育猪群。诱发此病的主要因素是：仔猪的早期隔离断乳和以及断乳后的多点饲养管理、呼吸道病毒（PRRSV、SIV、PRV）的感染和猪肺炎支原体的存在[1]。PRDC的病原因子既包括病毒,也包括细菌，其中PRRSV、肺炎支原体和PCV-2能够直接危害呼吸道免疫系统，是PRDC的主要影响因子[2]。由于多病原的混合感染，使病情复杂化，增加了诊断和防治难度，给从业者造成严重的经济损失。作者简介：高淑霞（1969－），女，在读博士，主要从事动物微生物与免疫学方面的研究。基金项目：山东科学技术厅资助项目（项目编号：022010103）*通讯作者：为此，我们采用新近发展起来的基因芯片技术，借助多重PCR、核酸杂交以及核酸标记技术,建立了可同时检测猪流感病毒（swineinfluenzavirus,SIV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)、猪圆环病毒2型(porcinecirocovirus-2,PCV-2)和猪伪狂犬病病毒(porcinepsudorabiesvirus,PRV)基因芯片检测方法。1材料与方法1.1材料1.1.1病毒SIV、PRRSV、PCV-2、PRV。（病毒分离株的来源？）1.1.2受体菌E.coliJM109由山东澳兰生物工程研究院保存。1.1.3主要试剂PCR试剂、RNaseInhibitor、pMD18-TSimpleVector、T4DNAligase、IPTG、X-gal购自大连宝生物；M-MLVreversetranscriptase为Promega公司产品；DNArecoverkit购自V-gene生物技术有限公司；鲑鱼精子DNA为Sigma公司产品。1.2方法1.2.1引物设计根据Genbank发表的核酸序列，分别针对A型流感病毒的M基因、PRRSV的N基因（ORF7）、PCV-2的cap基因、PRV的TK基因设计引物，由上海赛百盛合成。引物序列以及扩增片段长度见表1。表1引物序列及扩增片段长度Table1primersequenceandproductlength病毒Virus引物序列Primersequence扩增片段长度Productlength(bp)SIV5-CTGGTGCACTTGCCAGTTG-35-GATCAAGAATCCACAATATC-3460PRRSV5’-GCTGGGTAAGATCATCGC-3’5’-ACACGGTCGCCCTAATT-3’408PCV-25’-TGGCTGCCCTGGGATGATCTA-3’5’-TCCTACCACTCCCGCTATTTC-3’565PRV5’-CAGAACGGCAGCCTGAGCG-3’5’-CCGAAGAGGGTGTCCTGGAGC-3’5451.2.2重组质粒的构建采用PCR或RT-PCR获得各病毒核酸的特异片段，连接到pMD18-TSimplevector构建重组质粒，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用IPTG/X-gal/Amp选择平板进行蓝白斑筛选。经PCR鉴定为阳性的质粒由上海鼎安生物公司测序,序列正确的重组质粒扩大培养用于制备探针。1.2.3芯片的制备1.2.3.1芯片设计芯片采用4×4阵列，每条探针、阳性对照、阴性对照和空白对照各2个位点。阳性对照为猪血红蛋白珠蛋白基因片段（S），不管试验结果怎样，该位点都能产生可被识别的信号[3]。阴性对照是一段与靶基因同源性较低的鸡血红蛋白珠蛋白基因片段（C），不管试验结果怎样，该位点都不会产生可被识别的信号[3]。空白对照（B）为点样缓冲液。SSIVPRRSVPCV2SSIVPRRSVPCV2PRVBCPRVBC图1芯片阵列分布图Fig1Arraydistribution1.2.3.2探针的制备分别提取各重组质粒，PCR扩增目的片段，扩增产物切胶回收，测定浓度，调整浓度约为200ng/µl，100℃变性5min，冰浴5min，-20℃保存备用。1.2.3.2点样将预处理的硝酸纤维素膜剪切固定后，按图1设计好的排列方式将各探针和对照用芯片点样仪进行点样，80℃固定2h，密封，4℃保存备用。1.2.4待检样品的制备和标记1.2.4.1病毒核酸的提取将临床疑似病例的肺组织用PBS匀浆稀释（1∶5比例），-20℃冻融3次，4℃12000r/min离心10min，吸取上清400µl，加入600µl裂解液，震荡混匀后静置5min，加入400µl氯仿，震荡混匀,12000rpm离心10min，取上清，加入等量-20℃预冷的异丙醇，室温沉淀30min，75%乙醇洗涤一次，沉淀自然干燥。1.2.4.2反转录用SIV和PRRSV两对引物进行反转录。反转录体系：5×Buffer4µl，10mMdNTP2µl，M-MLVreversetranscriptase200u，RNaseInhibitor40u，加DEPCH2O至20µl，42℃反转录1h。1.2.4.3样品标记取反转录产物2.0µl，用混合引物进行PCR扩增，在此过程中掺入Biotin-11-dUTP。PCR体系为：10×Buffer2.5µl，Mg2+(25mmol)3.0µl，dNTP(2.5mmol，dTTP1.8mmol)3.0µl，dUTP3µl,TaqDNApolymerase(5U/µl)1.0µl，混合引物4µl，RT产物2.0µl，加ddH2O至25µl。循环参数为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环；72℃终延伸5min。1.2.5标记样品与芯片杂交杂交过程在芯片杂交仪上进行。1.2.5.1预杂交每片芯片加450μl预杂交液，42℃预杂交40min。1.2.5.2杂交弃掉预杂交液，将20μl标记PCR产物l00℃变性5min，置冰水中5min，与400μl杂交液混合，加到芯片盒中。58℃杂交1h。1.2.5.3洗涤用2×SSC、0.1%SDS和0.1×SSC、0.1%SDS各洗涤3次，每次1min。1.2.5.4酶联加酶联液（链亲和素碱性磷酸酶），酶联20min。1.2.5.5显色酶联结束洗涤三次后，加底物液(BCIP/NBT)显色15min，用双蒸水充分冲洗芯片终止显色，干燥。1.2.5.6杂交结果的检测及结果判定用芯片扫描仪进行读片，作为监测系统，阳性对照呈阳性，阴性和空白对照呈阴性，检测结果有效。通过对阳性对照杂交芯片各位点信号值的统计，制定以下判定标准：信号值≤0.1判定为阴性，≥0.2判定为阳性，介于0.1和0.2之间判定为可疑，同时输出检测报告。2结果2.1阳性重组质粒的鉴定2.1.1PCR鉴定碱法小量提取质粒，分别用相应引物扩增，PCR产物电泳结果显示重组质粒构建成功，结果见图2。1234M图2各质粒PCR产物电泳结果Fig2PCRresultsofrecombinantsM,DNAMarkerDL2,000；1-4分别为SIV、PRRSV、PCV-2、PRV的重组质粒PCR产物。2.1.2测序鉴定将重组质粒的测序结果与Genbank已发表的序列进行同源比较，结果显示插入片段与对bp20001000500100应的病毒序列的同源性都在98%以上,说明插入片段为病毒的特异片段。2.2芯片特异性试验结果分别提取4种病毒的核酸，用混合