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1肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则（第二次征求意见稿）二零一三年十一月2目录一、前言.........................................3二、适用范围.....................................4三、注册申报资料要求.............................4(一)综述资料....................................5(二)产品说明书..................................5(三)拟定产品标准及编制说明.....................12(四)注册检测...................................13(五)主要原材料研究资料.........................14(六)主要生产工艺及反应体系的研究资料...........19(七)分析性能评估资料...........................19(八)参考值（参考范围）确定资料.................25(九)稳定性研究资料.............................25(十)临床试验研究...............................26四、名词解释....................................32五、参考文献....................................343肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则（征求意见稿）一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是针对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。4二、适用范围本文所述肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂是指利用基于聚合酶链式反应（PCR）方法的核酸检测技术，以肿瘤个体化治疗相关的突变基因为检测目标，对人体样本（包括组织、体液等）提取的核酸组分中的目标序列进行体外检测的试剂。本文所指基因突变的类型包括置换、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常及RNA表达异常等广义的基因突变。本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法确立的，对于高分辨熔解曲线PCR方法、Luminex平台或核酸检测芯片等其他基于PCR的分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据实际产品特性对不适用部分做适当修订或补充需要的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证其科学合理性，同时确认性能评价的充分性。本文所涉及试剂的方法学不包括荧光原位杂交（FluorescenceinsituHybridization，FISH）、核酸序列测定、染色体核型分析及免疫组化技术等用于肿瘤个体化治疗指导的其他方法学。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。三、注册申报资料要求5(一)综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同基因突变类型检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若尚无同品种批准上市，则应详细论述作为检测靶标的突变基因与个体化治疗方案的相关性，说明理论依据。提交的资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关要求。(二)产品说明书说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均6应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。需要强调的是，产品说明书内容应与申请人前期完成的分析性能评估、稳定性研究、临床实验研究等技术资料完全一致。1.【预期用途】应至少包括以下几部分内容：（1）临床背景的介绍，包括相关适用人群特征、肿瘤的组织类型、适用的样本类型、待测靶基因序列的特征及选择依据，靶基因及其表达蛋白在恶性肿瘤发生、发展过程中可能起到的作用，相关药物或其他治疗技术及其作用机理、与待测突变位点可能存在的关系等。如未与具体治疗方案联合进行相应的临床验证，以上关于靶基因突变与肿瘤疾病及治疗方案的相关性描述仅仅来自诊疗指南、书籍、文献等资料，则在说明书中应注明参考资料的出处，预期用途的相关表述中不应涉及具体药物产品（商品）名称、生产企业信息等，并注明该产品未与具体药物联合进行临床验证，仅针对靶基因突变的检测性能进行了验证；若已将试剂盒与具体药7品联合进行了相关临床验证，可在此明确具体药物，并在说明书中对相关的临床研究情况进行简介。（2）试剂盒用于特定肿瘤患者人群，通过检测人体样本提取的核酸组分中是否存在靶基因突变，对临床上特定肿瘤患者的个体化治疗提供参考意见。肿瘤的类别及适用样本类型应结合实际的临床研究完成情况进行确认。（3）明确说明该试剂盒仅用于对特定肿瘤患者靶基因序列的检测，其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其它实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。2.【检验原理】（1）对试剂盒检测能够覆盖的所有突变位点或突变类型进行详细描述（靶序列长度、基因座位、突变类型及相关特征等），对引物及探针设计、不同样品反应管组合、对照品设置及荧光信号检测原理等进行逐项介绍。（2）核酸提取方法、原理等。（3）试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如添加了相关的防污染组分（如UDG/UNG酶等），也应对其作用机理作适当介绍。3.【主要组成成份】（1）详细说明试剂盒内各组分的名称、数量、内容物、8比例或浓度、稳定性等信息，阴性/阳性对照品（或质控品）可能含有生物源性物质的组分，应说明其生物学来源、活性及其他特性；说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。（2）试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，企业应列出相关试剂/耗材的名称、注册证号（如有）及其他必要的信息。（3）如果试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分，则应在此注明经验证后推荐配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的生产企业、产品名称以及该产品的医疗器械注册证号等详细信息。4.【储存条件及有效期】试剂盒的效期稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等。5.【适用仪器】所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。6.【样本要求】重点明确以下内容：（1）对适用的样本类型作详细介绍，包括样本来源及取材要求、样本处理方式（如组织样本的固定及包埋方式）、肿瘤细胞比例等。样本的取材及处理方式等若有通用的技术规范或指南，9则应遵循，并在此处引用。（2）样本处理及保存：核酸提取前样本的预处理、保存条件及期限（短期、长期）、运输条件等。（3）在提取过程结束后，可采用适当方法（如分光光度计法）对提取后的核酸储备液进行浓度、纯度检测，并依据性能验证结果在此给出用于扩增试验的核酸溶液浓度范围要求。举例：扩增反应终体系中需要50ng的DNA量，而在终体系中需加入25μl的DNA储备液，则在DNA提取完成后应将DNA储备液的浓度调整至2ng/μl的浓度。如提取后的核酸储备液浓度范围不符合要求，应重新取材或扩大样本量再进行核酸提取。（4）操作过程中各种制备液的稳定性要求，如各类混合液（Mix）、DNA/RNA储备液、反应终体系等(常温/冷藏/冷冻/冻融次数限制等）。7.【检验方法】详细说明实验操作的各个步骤，包括：（1）试剂配制方法、注意事项。（2）详述核酸提取的条件、步骤及注意事项。对照品（质控品）应参与样本核酸的平行提取（如有必要），以对核酸提取环节进行合理的质量控制。（3）扩增反应前准备：各组分加样体积、顺序、相关注意事项等。10（4）逆转录过程（如涉及）的温度和时间设置、PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置及相关注意事项。（5）仪器设置：特殊参数，待测基因、内标和外标的荧光通道选择等。8.【参考值（参考范围）】参考值（参考范围）的描述包括基线的确定方法和循环阈值（Ct值）的要求。除Ct值要求外，建议结合是否出现典型S形曲线对结果进行判断。9.【检验结果的解释】结合阳性对照、阴性对照以及样本管中靶基因和内标的检测结果（Ct值），对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述。如存在检测灰区，应对灰区结果的处理方式一并详述。10.【检验方法的局限性】（1）本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者个性化治疗的选择应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。（2）阴性结果不能完全排除靶基因突变的存在，样本中肿瘤细胞过少、核酸过度降解或扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成阴性结果。（3）肿瘤组织（细胞）可能存在较大异质性，不同部位取样可能会得到不同的检测结果。11（4）不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验操作和实验环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。（5）明确该检测仅限于规定的样本类型及检测系统（包括适用机型、核酸提取试剂、检测方法等）。11.【产品性能指标】详述以下性能指标：（1）对相应国家参考品（如有）检测的符合情况。（2）最低检测限：试剂盒能够覆盖的所有突变靶序列的最低检出浓度，重点考虑原始模板中突变基因的百分率和扩增终体系中核酸浓度两个因素对最低检测限的影响。简单介绍最低检测限的确定方法以及对最低检测限验证所采用的靶序列的信息。（3）企业内部阳性/阴性参考品符合率，阳性/阴性参考品的组成、来源、浓度梯度设置以及评价标准等信息。（4）精密度：精密度参考品的组成、来源、浓度梯度要求及评价标准。建议以列表的方式表示不同浓度精密度参考品的检测结果（变异系数）。（5）分析特异性①野生型验证：应采用不同浓度的野生型核酸样本进行验证，其结果应均为阴性。②试剂盒内交叉反应：如考核试剂包括对多个突变位点的检测，则应对该试剂盒覆盖范围内的所有突变类型间进行12交叉反应验证。③序列相近或具有一定同源性的其他较常见突变或野生型基因序列间的交叉反应验证。④潜在干扰物质验证。如果经验证发现某些序列与靶序列的交叉反应出现阳性结果，则应该对存在交叉反应的核酸序列及浓度进行验证并在产品说明书中表明这种假阳性发生的可能，做出相关的提示。（6）对比试验研究（如有）：简要介绍参比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。12.【注意事项】应至少包括以下内容：（1）如该产品含有人源或动物源性物质，应给出