反转录和PCR

宋国华，副教授，山东省泰山学者岗签约科研骨干主要学位与学习经历:•2008年韩国延世大学获得博士学位学会职务:•中国医促会氢分子生物医学专业委员会委员主要学术方向:•脂蛋白代谢与动脉粥样硬化、心脑血管病干预靶点的研究发表论文情况:•发表SCI学术论文18篇，包括JournalofLipidResearch等主持项目情况:•现主持国家自然科学基金项目、山东省科技攻关、山东省博士基金和泰安市科学技术发展计划多项获奖情况:•2013年荣获“第十一届泰安市青年科技奖”。2009年获得第十次全国动脉粥样硬化学术会议青年优秀论文评选一等奖，2012年获得脂质代谢与器官损害国际学术研讨会青年学者优秀论文奖。2014年参与获得山东省高等学校优秀科研成果奖一等奖。反转录和实时荧光定量PCR技术的原理及应用(ReverseTranscriptionandRealtimeQuantitativePCR)泰山医学院动脉粥样硬化研究所宋国华[e-mail]-PCR逆转录（reversetranscription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。是RNA病毒的复制形式，需逆转录酶的催化。艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。逆转录与反转录严格意义上来说没有什么区别，但是逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程；反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，逆转录在体内，反转录在体外。实验步骤Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端PolyA+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。反转录实验步骤1．电泳和分光光度计定量RNA。2．反转录体系:(20μl)37℃孵育60min3．将逆转录产物进行PCR反应或荧光定量PCR反应。1g•单管一步法反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。•两步法反转录和PCR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，这可能是因为体系更加单一比较利于PCR的进行。•RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-timePCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitativePCR)或者QRT-PCR(quantitativereal-timePCR)。PolymeraseChainReaction(PCR)一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90℃-95℃）,低温退火（50℃-65℃，1-2min），中温延伸（65℃-75℃）这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。DefinitionofPCR实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理-----------扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理---------定量原理•理想的PCR反应：•X=X0*2n•非理想的PCR反应：•X=X0(1+Ex)n•n：扩增反应的循环次数•X：第n次循环后的产物量•X0：初始模板量•Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量实时荧光定量PCR原理---------标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理绝对定量25讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor实时荧光定量PCR原理---------DNA产物的荧光标记QQR实时荧光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreenSYBRGreen法工作机理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreen实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析•将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGreen法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量SYBRGreen法------------PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同SYBRGreen法应用范围起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBRGreen法优缺点对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点与目标序列互补实时荧光定量PCR方法2-------TaqMan法TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同乙肝病人血液中HBV的绝对定量目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测设置对照：浓度为106、105、104、103的标准样品各一个，设阴性和空白对照实验步骤：提取HBVDNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序结果：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数利用TaqMan法检测血液中的HBV数据分析分析结果：HBVDNA的精确copy数为3.7X105利用TaqMan法检测血液中的HBVTaqMan法应用范围起始模板的定量基因型分析目的基因定量产物鉴定SNP分析TaqMan法优缺点对目标序列的高特异性------阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点实时荧光定量PCR方法3-------Molecularbeacon法(分子信标)标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂发夹型杂交探针Molecularbeacon(分子信标)工作原理荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光-----变性过程：产生非特异性荧光-----延伸过程：不产生荧光------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecularbeacon(分子信标)应用范围起始模板的定量基因型分析产物鉴定SNP（单核苷酸多态性）分析Molecularbeacon(分