反转录说明书

研究用CodeNo.RR036A说明书PrimeScript™RTMasterMix(PerfectRealTime)v201412Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●试剂盒外必备材料1●保存1●特长1●使用注意2●操作方法2●RealTimePCR2●实验例5●附录5●关联产品7●制品说明本制品是2StepRealTimeRT-PCR用的最佳反转录反应试剂。5×PrimeScriptRTMasterMix中含有定量RT-PCR的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScriptRTase、RNaseInhibitor、Random6mers、OligodTPrimer、dNTPMixture、反应Buffer），加入模板RNA和水即可迅速进行反应。使用具有较强延伸能力的PrimeScriptRTase，与制品PrimeScriptRTreagentKit（PerfectRealTime）（CodeNo.RR037A/B）相同，可以在较短时间内高效合成RealTimePCR用模板cDNA。本制品合成的cDNA可以用于SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的与SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)和PremixExTaq(ProbeqPCR)等定量试剂配合使用，能够进行高性能的基因表达分析。注意：TakaraBio使用SYBR®GreenI作为研究试剂已得到MolecularProbesInc.的许可。SYBR®为MolecularProbesInc.的注册商标。●制品内容（10μl反应×200次）1.5×PrimeScriptRTMasterMix（forRealTime）*1400μl2.RNaseFreedH2O1ml×2支3.EASYDilution（forRealTimePCR）*21ml*1：含有PrimeScriptRTase、RNaseInhibitor、Random6mers、OligodTPrimer、dNTPMixture、反应Buffer（含有Mg2+）。*2：制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TEBuffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASYDilution也可以单独购买（CodeNo.9160）。注意：EASYDilution请与本公司RealTimePCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。●试剂盒外必备材料热循环仪（或37℃水浴和85℃加热块）反转录反应所用0.2ml和1.5ml的微量反应管微量移液器和枪头（高压灭菌）●保存：-20℃。●特长1．制品为预先混好的Premix形式，只需加入模板RNA和水便可以开始反应。2．可以在较短时间内高效合成RealTimePCR用cDNA，是进行2StepRealTimeRT-PCR反应的最佳试剂。3．使用了Random6mers和OligodTPrimer2种反转录引物，可以合成最适的RealTimePCR用cDNA。4．Real-timeRTPCR定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总RNA和反转录cDNA稀释到较低的浓度。如果用水或TEBuffer稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结果精度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASYDilution（forRealTimePCR），将TotalRNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。-1-●使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1．5×PrimeScriptRTMasterMix在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于5×PrimeScriptRTMasterMix粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。2．分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。3．本制品中已经加入了反转录Primer（OligodTPrimer和Random6mers），如果要使用GeneSpecificPrimer进行反转录反应，则不能使用本制品。●操作方法反转录反应RNA的制备方法参见“附录”。1.按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2μl1×TotalRNA*RNaseFreedH2Oupto10μl*反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的TotalRNA。2.轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下:37℃15min（反转录反应）85℃5sec（反转录酶的失活反应）4℃注意：得到的RT反应液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，其加入量不要超过RealTimePCR反应体积的1/10（V/V）量。●RealTimePCR以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（CodeNo.RR820A）进行RealTimePCR反应的操作方法。采用TaqMan®探针法进行检测时，请选择PremixExTaq（ProbeqPCR）（CodeNo.RR390A）。◆应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystemII扩增仪的操作方法1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1.0μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）1.0μl0.4μM*1RT反应液（cDNA溶液）2μl*2dH2O（灭菌蒸馏水）8.5μlTotal25μl*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2建议在25μl反应液中使用相当于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。-2-2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Repeat：195℃30秒Stage2：PCR反应Repeat：4095℃5秒60℃30～60秒Stage3：Dissociation◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。3.实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。◆应用AppliedBiosystems7300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem和StepOnePlus™Real-TimePCRSystem的操作方法*请按照仪器使用说明书要求进行实验操作。1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）10μl25μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.8μl2μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.8μl2μl0.4μM*1ROXReferenceDyeorDyeII（50×）*20.4μl1μl1×RT反应液（cDNA溶液）*32μl4μldH2O（灭菌蒸馏水）6μl16μlTotal20μl*450μl*4*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2ROXReferenceDyeII（50×）比ROXReferenceDye（50×）浓度低，使用7500Real-TimePCRSystem和7500FastReal-TimePCRSystem时，请使用ROXReferenceDyeII（50×）。使用StepOnePlus™Real-TimePCRSystem和7300Real-TimePCRSystem时，请使用ROXReferenceDye（50×）。-3-*3建议在20μl反应液中使用相当于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。*4按不同仪器的要求确定反应液的体积。2.进行RealTimePCR反应建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。当使用Tm值较低的引物或两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。AppliedBiosystems7300/7500Real-TimePCRSystem,StepOnePlus™两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Reps：195℃30秒Stage2：PCR反应Reps：4095℃5秒60℃30～34秒*DissociationStage*使用StepOnePlus™时请设定在30秒。使用7300时请设定在31秒。使用7500时请设定在34秒。AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystem两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Reps：195℃30秒Stage2：PCR反应Reps：4095℃3秒60℃30秒DissociationStage◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。3.实验结果分析反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。-4-●实验例反转录反应时间和cDNA合成量的研讨实验[方法]1.反转录反应试剂：PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）模板：HumanPlacentaTotalRNA2pg～2μg反应体积：20μl反应条件：37℃15、30、60min反应后85℃5sec热变性，4℃保存2.RealTimePCR反应试剂：SYBR®PremixExTaqII（PerfectRealTime）模板：上述反转录反应液2μl反应体积：25μlTargetGene：HumanACTB反应条件：ThermalCyclerDiceRealTimeSystem标准反应条件[结果]RealTimePCR扩增曲线图及标准曲线图如下：扩增曲线图标准曲线图以上RealTimeRT-PCR扩增结果显示，不同反转录反应时间（15、30、60min）在宽广模板浓度范围内都可以得到同等的扩增效率。●附录RNA样品制备本制品是将RNA反转录成cDNA的专用试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而