第十六章药物分析中的新技术新方法

第十六章药物质量控制中现代分析中的技术与方法手性分离色谱一、手性药物的现状手性药物（579）药物（1992）天然和半合成药物（556）合成药物（1436）非手性药物（857）单一异构体（73）外消旋体（506）手性药物（547）非手性药物（9）单一异构体（537）外消旋体（10）二、手性药物对映体的药效学差异1.治疗作用完全依赖一种异构体如：S(-)-α-甲基多巴2.药理作用差别不大如：异丙嗪3.药理作用类似，但反应强度有差别4.药理与毒理作用存在“质”的区别二、手性药物对映体的药动学差异1.吸收2.蛋白结合3.代谢1.间接法拆分对映异构体即衍生化试剂法（CDR）2.直接法拆分对映异构体•手性固定相法（CSP）•手性流动相添加剂法（CMP）三、手性药物拆分的高效液相色谱法分类•采用非手性固定相四、拆分原理：为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源（CDR），使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。三点手性识别模式(R)–SE+(R)–SA→(R)–SE–(R)–SA(S)–SA→(R)–SE–(S)–SA1.CDR柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。CBDAECBADECBADCXYZCDABCYXZCDABCXYZCBADCYXZ手性衍生化特点：1.需要高光学纯度的手性衍生化试剂；2.反应繁琐费时；3.衍生化反应速率重现性较差4.只需使用价格便宜、柱效较高的非手性柱5.衍生化过程可同时纯化样品柱前衍生化-反相高效液相色谱法拆分酮洛芬对映异构体S-()-酮洛芬R-(-)-酮洛芬酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图＊＊酮洛芬对映体的柱前衍生化方法酮洛芬对照品溶液(1mg/mL)0.1mL加入正己烷0.6mL二氯亚砜溶液0.2mL75℃1h冷却至室温吹干后加入S-NEA溶液0.2mL5min振摇加入2.0mol/LH2SO40.5mL混匀吹干后溶解进样二氯甲烷:乙醚2:1•色谱条件色谱柱：HypersilC18,5m,1505.0mmID，流动相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55:45:0.1:0.02，v/v)，流速：1ml/min,检测波长：254nm酮洛芬对映体衍生化物色谱图min2468101214mAu050100150200RS酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为tR=7.3min，tR=8.5min，分离度为1.92.CSP利用手性固定相与对映体消旋物相互作用，其中一个与手性固定相生成不稳定的短暂的对映体复合物，使两种异构体在色谱柱上的保留时间不同，从而得到分离。常用的手性固定相：1.Pirkle型固定相2.合成多聚固定相3.环糊精键合固定相特点1.适用范围广2.制备分离方便3.定量分析的可靠性高4.价格昂贵奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（A）和苯丙氨酸（B）的p-溴代苯甲酰胺衍生物对映体色谱图3.CMP将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与药物消旋物中各对映体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配的差异，实现对映体的分离。常用的手性添加剂：1.配基交换型手性添加剂2.手性离子对络合剂3.环糊精添加剂特点1.可采用普通的非手性固定相2.不需对样品进行衍生化3.手性添加物的可变范围较宽五、应用1．对某些手性药物进行对映体的纯度检查；2．生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；3．在研制手性药物过程中，可分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；4．必要时，可进行手性药物对映体的制备分离（或拆分）。高效毛细管电泳（HPCE）HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的一种快速、高效的液相分离技术。具有以下特点：1.高效2.高速3.微量4.低消耗高压电源毛细管恒温系统检测器数据处理系统毛细管缓冲液/样品缓冲液（+）(－)毛细管电泳装置示意图（一）基本原理：v=veo+vep=(μeo+μep)Eveo：电渗流速度μeo：电渗流淌度vep：电泳流速度μep：电泳流淌度E：电场强度－－－－－－－－－－－－－－－－－－++++++++++++++++++++++++++(－)(+)电渗的产生－－－－－－－－－－－－－－－－－－(－)(+)++++++++++++++++----------------毛细电泳中不同组分的迁移示意图（二）主要分离模式1.毛细管区带电泳（CZE）2.胶束动电毛细管色谱（MECC）3.毛细管凝胶电泳（CGE）4.毛细管等电聚焦（CIEF）模式缓冲液体系分离机理CZE自由缓冲液离子淌度MECC胶束－缓冲溶液疏水性/离子性相互作用CGE凝胶－缓冲溶液分子大小和荷电数目CIEF两性电解质等电点毛细管区带电泳最基本、最广泛的分离模式。适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，但不能中性物质及质荷比相同的组分。2.胶束动电毛细管色谱用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶液，使中性组分可按其疏水性的不同及在两相间的分配系数的不同而分离。采用手性分配相，可用于手性化合物的分离。3.毛细管凝胶电泳凝胶的网络结构对溶质具有分子筛的作用，可分离质荷比相同但分子大小不同的组分。在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广泛的应用。4.毛细管等电聚焦根据蛋白质的等电点不同而进行分离。AAAAAABBBBBBCCCCDDDDDEEEEEFFAAAABBBBCCCCDDDDEEEEFFFFpH梯度高低应用：1.监测药物生产过程如：监测青霉素发酵液中有关物质的量青霉素发酵液的高效毛细管电泳图1.青霉素G钠；2.6-APA；3.对羟基苯乙酸；4.邻羟基苯乙酸；5.苯乙酸2.中药成分分析如：黄酮及其甙类分析黄芩中6种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱分离图1.汉黄芩甙；2.黄芩素；3.黄芩甙；4.千层子素；5.汉黄芩素；6.内标水杨酸；7.白杨素3.手性拆分4.体内分析质谱法及其应用进样系统离子源质量分析器检测器控制和数据处理系统真空系统一、离子源及离子化技术1、EI（电子轰击离子化）V加速电压试样蒸汽阴极阳极电子束离子xyz电子轰击质谱示意图优点：灵敏度高，有丰富的碎片离子信息和成熟的离子开裂理论，是结构分析、鉴定的有力手段；重现性好，有标准图谱，可以通过谱库检索对未知物进行结构鉴定。缺点：样品须汽化后才可离子化适用化合物：易挥发、热稳定化合物。2、CI（化学离子化）软电离技术优点：可以得到较强的准分子离子峰，有利于分子量的测定缺点：样品须汽化后才可离子化适用化合物：易挥发、热稳定化合物3、FAB（快原子轰击离子化）软电离技术优点：样品不须汽化；既给出化合物的分子量信息，又给出结构信息。适用范围广，仪器商品化较早，普及率高。缺点：重现性差，灵敏度较EI低。适用化合物：极性、高分子量、非挥发性及热不稳定化合物。+++++快原子枪样品靶原子束质量分析器二次离子束快原子轰击质谱示意图4、MALDI（基质辅助激光解吸离子化）软电离技术优点：通常只给出分子离子峰（或准分子离子峰）。适用化合物：蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物大分子5、API（大气压离子化）软电离技术（1）ESI（电喷雾离子化）特点：能够产生多电荷离子。适用化合物：对生物大分子及其他分子量大的化合物的分析较有利。+++++－－－－－－+++++－－－－－－+++－－－－＋－－＋毛细管+4kV含离子的液滴随液滴蒸发，电场加强，离子向表面移动离子从表面蒸发离子蒸发机理（2）APCI（大气压化学离子化）最软的电离方式之一特点：一般只给出化合物的分子量信息，通过源内CID（碰撞诱导分解）可同时获得结构信息。适用化合物：与ESI比较，更适于分析极性及分子量小（＜1000amu）的化合物。反应气等离子体Corona放电电极真空样品+溶剂雾化气加热管APCI电离原理二、质量分析器及质量分离原理1、扇型磁场质谱仪2、四极质谱仪3、飞行时间质谱仪4、离子阱质谱仪核磁共振光谱分析法核磁共振光谱广泛用于化合物的结构分析，而其在化合物的定量分析中的应用则是比较新的内容，日益受到重视。1．定量参数：峰面积或峰高。2．定量的特点：1）对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。2）利用内标法或相对比较法分析混合物中某一化合物时，物需该化合物的纯品作为对照标准。3）峰很窄，远小于各化合物之间的化学位移的差值，因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。4）方法简单快速、准确、专属性高，不破坏被测样品，可选择性的测定混合药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体。3．测定方法：选择一个合适的峰作为测量峰。（1）内标法（绝对测量法）内标法为NMR定量分析最常用的方法，它与GC的内标法相似，在样品溶液中，直接加入一定量内标物质后，NMR光谱测定，将样品指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对重量（Wu）可由下式求得：WuAuEuAuEu-----=----×----Wu=Ws×----×----WsAsEsAsEsWu百分含量=-----×100%W（2）相对测量法当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以指定基团上一个质子引起的吸收峰面积（A1/n1）和杂质基团上一个质子引起的吸收峰面积（A2/n2）进行比较，按下式计算：A1/n1样品的相对含量=---------------×100%A1A2-----+-----n1n2