薄层色谱及柱色谱

LOGO薄层色谱及柱色谱指导教师：徐晓林13466100066LOGO一、实验目的1、掌握色谱法的基本原理及其应用。2、掌握薄层色谱及柱色谱的操作技能。LOGO二、色谱法基本原理1.色谱法又称为层析法，是分离，纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。2.色谱法的基本原理是利用混合物各组分在两相间（流动相和固定相）的吸附或分配（溶解性能）的差异。即当混合物随流动相流经固定相时，由于固定相对各组分的吸附或溶解性能的不同，经过两相间反复多次的吸附或分配，使吸附较弱或溶解度较小的组分在固定相中移动较快，从而使各组分得到分离。3.色谱法的应用主要包括以下几个方面：（1）分离混合物（2）精致提纯化合物（3）鉴定化合物（4）跟踪反应进程4.两相中，相对固定不动的一相称为固定相，移动的一相称为流动相。LOGO三、色谱法的分类（1）薄层色谱：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层来进行物质分离及分析的方法。按其操作不同，可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱和高效液相色谱。（2）柱色谱：将固定相装在色谱柱中，使样品沿着色谱柱移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。（3）纸色谱：用滤纸等作为液体的载体，将样品点在纸上随后展开而达到分离鉴定的方法。（4）气相色谱：是以气体为流动相的色谱法。LOGO三、色谱法的分类（1）吸附色谱：利用吸附剂对不同组分吸附能力的不同加以分离的方法。（2）分配色谱：利用不同组分在流动相和固定相中的分配系数不同而进行分离的方法。（3）离子交换色谱：利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和力不同而进行层析分离的方法。按其作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。（5）高效液相色谱：是利用液态的流动相在高压驱动下流经填充着固定相的色谱柱时，加载的样品得以分离，并利用各组分不同的物理性质加以检测。（4）凝胶渗透色谱：利用不同组分之间分子大小不同，在通过凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进行分离的方法。LOGO四、薄层色谱1.薄层板的制备：（1）固定相的选择：吸附色谱：氧化铝、硅胶（H——不含黏合剂）分配色谱的支持剂：硅藻土、纤维素（F——含荧光物质）（G——含煅石膏2CaSO4·H2O黏合剂)？HF254GF254薄层板的制备点样展开显色，计算、分析LOGO四、薄层色谱（2）制板：干法和湿法取3g硅胶G与6-7mL0.5%-1%的羧甲基纤维素钠的水溶液在烧杯中调成糊状物平铺或浸渍室温晾干后，放入烘箱内加热活化通常用六中染料确定活性LOGO四、薄层色谱2.点样（2）通常将样品溶于低沸点溶剂（丙酮，甲醇、乙醚等），根据使用的固定相配成0.5%-5%的溶液，用内径小于1mm管口平整的毛细管，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2-3mm。（1）点样前，先在薄层板上据底端1cm处，用尺子、铅笔轻画一横线作为起始线.（3）同一块板可点几个样品点，但是间距应为1-1.5cm。点样要轻，不可刺破薄层！毛细管在薄层上的停留时间不能太长，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，影响分离效果。（4）点样结束，必须待样品点干燥后，方可进行展开。LOGO四、薄层色谱3.展开（2）展开操作：a.先在密闭的展开槽内倒入少量配好的展开剂，高度不能超过1cm。待其蒸气饱和，以达到平衡。（约5min）b.将点样后的薄层板放入展槽中，先不要接触展开剂，让薄层板吸附蒸气以达饱和。（约3min）c.将点样的一端放入展开剂中，垫高薄层板，始终使薄层板浸入展开剂为0.5cm，展开剂高度绝对不能浸过起始线！d.待溶剂前沿离顶端1cm左右，就应取出薄层板，待展开剂挥干后，观察分析。绝对不能使展开剂漫过薄层板的顶端！（1）展开剂的选择：根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素考虑。LOGO四、薄层色谱4.显色、计算及分析（1）若样品本身是有色的，可以直接观察到分离的过程及结果。若无色，则可通过以下几种方法显色：碘熏、紫外光灯、喷显色剂。（2）计算比移值（Rf）：LOGO四、薄层色谱（3）良好的分离，Rf值应在0.15-0.75之间，否则应更换展开剂重做。通常样品的极性越大，Rf值越小。（4）在一定的操作条件下，即色谱条件一定，比移值（Rf）只与组分性质有关，因此可用来鉴定化合物。（定性）但是Rf值除了决定于物质的结构外，还与吸附剂的含水量、薄层厚度，展开剂纯度、温度等外界因素有关，因此薄层色谱几乎不用于定性，常用来分析样品中的组分。LOGO五、柱色谱柱色谱：是将吸附剂（固定相）装入一根带有下旋塞或无下旋塞的玻璃管中，将样品溶于溶剂，随洗脱剂（流动相）沿着色谱柱，进行分离的方法。装柱展开及洗脱LOGO1.装柱：是柱色谱最关键的操作，装柱的好坏直接影响分离效果。（1）装柱前，应先将玻璃柱洗净，干燥，垂直固定在铁架台上。在柱底铺一小块脱脂棉，再铺约0.5cm厚的石英砂，然后进行装柱。有湿法和干法两种装柱方法。五、柱色谱（2）湿法装柱：将固定相（如硅胶）用洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将糊状物边震荡边倒入柱中，同时，打开下旋塞，用一干净干燥的烧杯接收洗脱剂。待糊状物全部装完后，用接收到的洗脱剂转移残留的固定相，并将柱壁上的固定相淋洗下去。装柱过程中，应不断轻敲色谱柱，以使固定相填充均匀、无气泡！整个装柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于固定相最上端，否则柱内会出现裂痕和气泡！LOGO五、柱色谱2.展开及洗脱：将样品溶解在最少量的洗脱剂中。滴加前，打开下旋塞，使洗脱剂流出，恰好下降到固定相表面时，关闭旋塞，开始将样品迅速全部滴加于柱顶端后，用一事先戳孔的圆形滤纸盖住样品表面，以防加洗脱剂时搅动柱顶表面。样品加完后，打开下旋塞，再立即加入洗脱剂进行洗脱。色谱带的展开过程就是样品的分离过程，可按颜色段收集各组分。（3）干法装柱：在色谱柱顶端放一干净干燥的漏斗，将干燥的吸附剂（固定相）倒入漏斗中，使其成为细流连续不断地装入柱中。要轻轻敲打柱身，使其填充均匀后，打开旋塞，从顶端加入洗脱剂冲柱，以排除气泡，并保留一定液面。LOGO五、柱色谱1.洗脱剂应连续平稳地加入，不能中断。洗脱过程中的注意事项：2.洗脱剂流出速度应控制在每分钟5-10滴。下移速度太快，分离效果不好，太慢，会造成色谱扩散或成分破坏，影响分离效果。LOGO思考题1.简述色谱法的基本原理及应用范围？2.色谱法按操作不同，可分为什么？按作用原理不同，又可分为什么？3.什么叫薄层色谱？其操作分为哪几个步骤？其定性依据是什么？怎么计算？4.什么叫柱色谱？柱中若留有空气或填装不均匀，对分离效果有何影响？LOGO感谢各位同学的倾听！