薄层色谱扫描法

薄层色谱扫描法中药二室一、薄层色谱扫描法简介二、影响薄层扫描定量的因素三、介绍CAMAG薄层扫描仪一、薄层色谱扫描法简介1、简述薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后产生的荧光强度。所得到的图谱及积分数据可用于药品的鉴别、检查及含量测定。中药材：山豆根、槲寄生、女贞子、牛黄、两面针、黄连等；中成药：六味地黄丸（浓缩丸）、元胡止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、二至丸、九分散等;2、检测方法(1)吸收法:扫描时测定薄层板上的样品斑点对光吸收强度的方法。(2)荧光法:测定样品斑点经激发后产生的荧光强度的方法。(3)荧光淬灭法:利用某些化合物减弱吸附剂中荧光剂的紫外吸收强度而进行定量的方法。由于薄层板各部分荧光强度不均匀,对定量不太适用,而是便于斑点的定位。3、测量方式(1)透射法：测定照射光穿透样品斑点后光的吸收情况。(2)反射法：样品斑点对照射光的反射情况进行测定的方法。4、测光形式(1)单波长扫描：使用一种波长的光束对薄层进行扫描。适用于分离度好，背景干扰小的薄层色谱。(2)双波长扫描：用测定波长和参比波长分别扫描薄层后，测定样品斑点在两波长下的吸收度之差，可减少分离度欠佳的组分间的相互干扰，并减少薄层板的背景干扰，能显著改善基线的平稳性。操作时应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比波长。5、扫描方式(1)线性扫描：用一束比待测斑点略宽的狭窄光带沿展开方向做单向等速扫描。适于形状较规则斑点的扫描。在进行荧光测定时一般只用线性扫描。(2)锯齿扫描：使用微小正方形光束沿展开方向扫描的同时，在垂直于展开方向进行往复式扫描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿形或矩形，它对于形状不规则或分布不均匀的斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。6、定量方法(1)外标法：如果标准曲线经过原点，可用一点法校正；如果不通过原点，采用二点法校正，必要时用多点校正法。测定时，供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，每份供试品溶液点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个，其计算结果的相对平均偏差不得大于5%。计算公式:C=kA+b(kA+b)×稀释倍数点样量×称样量(2)内标法：将内标加入供试品溶液和对照品溶液中以峰面积的比值为定量依据.由于内标物的选择比较困难，目前应用较少。内标物：a.在样品溶液中加入一种在样品溶液中不存在的，b.性质与被测物质类似且又与样品中被测成分得易分离的纯化物，7、系统适用性试验（1）检测灵敏度：指用于限量检查时，被测成分能被检出的最低量。（2）分离度：用于限量检查或含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度,应大于1.0。（3）重复性：指同一薄层板上同一供试品溶液相同浓度的数个斑点，扫描结果的偏差。不显色直接扫描，相对标准偏差应不大于3.0%，显色后扫描，相对标准偏差应不大于5.0%。二、影响薄层扫描定量的因素（一）吸附剂性能及薄层质量1、吸附剂：（1）吸附剂颗粒大小，分布均匀程度能影响分离度和检出限度。小颗粒且分布均匀的吸附剂，分离度好，灵敏度高。（2）吸附剂的含水量影响薄层活度，如果大气湿度过大，吸附剂含水量过高，导致薄层活度过低，就会影响分离效果，所以在点样前薄层板应进行活化在110℃干燥30分钟。（一）吸附剂性能及薄层质量2、薄层：薄层厚度会影响定量结果，厚度下降，展开后斑点扩散较严重，影响定量结果。用透射法测定时，峰面积值随薄层厚度下降而减小，用反射法测定，峰面积值随薄层厚度下降而增加。因此对吸附剂及薄层性能的规格化是薄层色谱重现性及定量准确性的先决条件。薄层板的种类硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板、氧化铝板。硅胶G板以石膏作为黏合剂；硅胶GF254板是添加荧光指示剂；常用的荧光指示剂有两种:一种是锰激活的硅酸锌（Zn2SiO4:Mn）,在254nm波长下能发出荧光;另一种是银激活的硫化锌、硫化镉（ZnS.CdS:Ag）,在366nm波长下能发出荧光。我们常用的是硅胶GF254板。硅胶H板是没有外加黏合剂。氧化铝板以氧化铝作为固定相，可以分离萜类，生物碱类，脂肪族及芳香族化合物。（二）点样1、一般为圆点状或窄细的条带状;点样基线距底边10-15mm;圆点状直径一般不大于3mm;条带宽度一般为5-10mm;点间距离不少于8mm。2、点样是薄层色谱的第一步,也是关键的一步,它既关系到能否得到可以重现的薄层色谱,也关系到定量测定结果的准确与否,点样量不宜过大,最好控制在10μl以下,点样过多或原点“超载”,展开剂产生“绕行”现象,使斑点拖尾或重叠,致使扫描峰形不对称,或达不到基线分离。(三)展开1、预饱和薄层各个部分对展开剂蒸气的预吸附程度不同,会影响色谱分离，因此当用展开剂时，先将薄层及展开缸进行预饱和,以便得到重现的色谱图。2、相对湿度：50%-60%较适宜相对湿度过大影响薄层活度,吸附剂吸附能力下降,分离效果不理想。3、温度:一般18-25℃较适宜温度变化会影响组分在两相间的分配,被分离物质的Rf值应在0.2-0.8较适合,Rf值太大,斑点易扩散,扫描重现差,Rf值太小,斑点没有完全展开,扫描结果不能代表真实浓度。4、边缘效应：同一化合物，在同一块薄层板上,用同一混合展开剂，在同一展开槽内展开后，薄层中间部分的斑点比薄层两侧边缘处的斑点的Rf值小。用展开剂将展开缸及薄层板饱和后再进行展开就可以消除边缘效应，饱和时间的长短因展开剂极性以及比例不同而异。5、展开剂(1)展开剂过多次数的重复使用，也会影响Rf值的稳定。多次使用展开剂时，实际上每一次的展开剂的组成,由于挥发、吸附等原因已有改变。最好是临用新配，这样每次展开剂少量、定量使用，以足够展层一次的用量为宜。(2)每一种溶剂在展开中都有其一定的作用：a.展开剂中比例较大的溶剂起溶解物质和基本分离的作用，极性相对较小：b.展开剂中比例较小的溶剂,极性较大，对被分离物质有较强的洗脱力，帮助化合物在薄层上移动，可以增大Rf值，但不能提高分辨率；c.展开剂中加入少量酸、碱可抑制某些化合物的斑点拖尾；比如：六味地黄丸测定山茱萸中的熊果酸，展开剂是：环己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸（20：5：8：0.1）d.展开剂中加入丙酮等中等极性溶剂可使不相混合的溶剂混溶，并可以降低展开粘度，加快展速。6、展距:一般为8-15cm在这种展距内得不到分离的组分,增加展距并非解决问题的办法,不仅延长了分离的时间,而且会引起斑点扩散反而降低分离度,因此,展距内分离不理想时,不能一味的增加展距,而是可以优化展开剂,以得到理想的结果。由此可见,展开时必须控制条件一致，得到重现的分辨率最佳的色谱，才能得到可靠的定性定量结果。（四）显色显色剂必须与样品定量反应,且灵敏度要高,专属性要强,色点稳定性好。常用的是喷雾法显色,分为自动喷雾、手动喷雾。自动喷雾的雾滴均匀而细,比手动喷雾得到的背景吸收小,重现性及定量准确度高。需注意的是：喷完显色剂后,需加热显色的,应注意控制加热的温度和时间，尤其含羧甲基纤维素钠的薄层板，温度过高或加热时间过长易焦化，如果用硫酸等显色剂可使板面炭化而影响显色效果；加热时间不够，导致斑点未显出或显色不完全；有的成分加热的温度和加热的时间不同.显色效果是有差别的。将显色的薄层板避光保存，以同样大小的玻璃板覆盖并密封，可增加色斑的稳定性。（五）薄层扫描定量（1）色谱条件不优化，操作技术不规范得到的色谱很差，就不可能得到准确的定量结果。（2）输入薄层扫描仪的参数不合理也会影响定量的准确性，扫描方向应保持一致，应沿展开方向扫描,不宜垂直于展开方向扫描。总之，要得到理想的色谱分离及准确的定量结果，色谱条件的标准化，操作技术的规范化是十分重要的。三、介绍CAMAG薄层扫描仪1、基本原理日本岛津生产的CS系列仪器瑞士CAMAG公司的薄层扫描仪基本原理：就是用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量的目的。2、基本用途（1）定性—光谱测定在波长200-800nm之间进行斑点原位扫描，测得该化合物的吸收曲线及最大吸收，并与对照品比较从而对样品中该成分进一步确证。CAMAG公司的WINCATS软件有斑点光谱图的储存功能，因此可对斑点光谱进行检索，可随时与分析样品或标准进行对比。（2）定量—色谱测定，前面已经介绍了定量方法：外标法、内标法等。3、CAMAG薄层扫描的组成部分（1）半自动点样仪：注意：样品溶液应澄清，防止溶液中的沉淀堵塞点样针。（2）数码照相系统暗箱:可见光、254nm紫外光、及365nm紫外光光源。注意：薄层照相前应挥干溶剂，防止溶剂污染,腐蚀仪器。(3)薄层扫描仪(1)由光源、单色器、薄层板台、检测器、WINCATS工作站组成。(2)光源：钨灯：可见光区370-800nm氘灯：紫外区190-450nm汞灯：220-650nm注意：（1）仪器使用过程中，当长时间不进行扫描（约2小时），应把仪器内部的三个光源灯（D2，W，Hg）通过手动控制面板熄灭，或关闭仪器电源。（2）仪器扫描结束后，应及时把薄层板取出，避免溶剂蒸气进入仪器内部，污染光路部件和腐蚀仪器。4、维护1、仪器工作环境：温度：18-35℃，相对湿度：85%以下；要远离酸性、碱性或其他会引起金属表面腐蚀的气体。2、仪器使用后要马上清洁薄层板装载台，避免溶剂或脱落的硅胶颗粒及残存试剂对仪器的腐蚀。3、仪器上盖不能摆放任何东西，包括纸张或溶剂瓶子，避免影响仪器散热和防止溶剂撒落到仪器表面和内部。谢谢