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第一章细胞培养：所谓细胞培养是指将有机体内的某一组织，如动物的肝、肾或肌肉等取出，分散成单个细胞，在人工条件下使其存活、生长和分裂的技术。细胞培养：使用单个细胞悬液(是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。)组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）(把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长)器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫(系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。)原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养（在培养条件下传１至１０代）。传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中（一般可传４０至５０代的细胞）。细胞株（cellstrain）：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就要出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能度过危机而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传40-50代次。并且保持原来的染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。此类细胞成为细胞株。从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cellstrain)。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。8细胞系（cellline）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finitecellline)，如可以连续培养，则称为连续细胞系(continuouscellline)，培养50代以上并无限培养下去。当细胞株传至50代以后又要出现危机，不能再传下去了。但有部分发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限地传下去，这类细胞称为细胞系。9原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期10培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长,见于各种实体瘤细胞;悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面,见于各种造血系统肿瘤细胞。11贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟—4小时贴壁。潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂，机制：接触抑制、密度依赖性。12血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。13培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2（培养液与液面上的空间比1：10或2~5mm，95%或100%饱和氧）CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒14细胞培养所需实验条件实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器等CO2培养箱倒置显微镜液氮罐耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用于玻璃器皿消毒滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。15使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内放3000毫升灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。16细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml17消化液胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用18培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限；成分复杂；易发生支原体污染。合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定；成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。19血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子；⑥转移蛋白；⑦不明成分。一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．20无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌21抗菌素的使用在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定22培养基的配制RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100U／毫升加三蒸水至1000ml过滤除菌调节pH值至7.2加血清（终浓度10％）23营养需要基本营养物质：包括氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子。促生长因子：体外培养细胞既需要上述基本营养物质，还需要促细胞生长因子等物质才能正常生长、繁殖。血清中含有多种这类物质，有利于多数细胞的存活和生长。24细胞传代方法1.悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.半悬浮生长细胞传代此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代，常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。25贴壁生长细胞传代方法1吸光培养瓶中的培养液；2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10min（显微镜下动态监测）；3吸去胰蛋白酶液，加入新鲜培养液；4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液；5吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内；6加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内；7将后者放入培养箱中培养。26培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。一、细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆，克隆形成率可用来表示细胞的增殖能力：克隆形成率＝克隆形成数／接种细胞数此方法优点是精确、可靠但缺点是操作繁琐二、台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力（此方法基本已被淘汰）。三、四唑盐（MTT）比色法活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与其含量成正比，可用酶标仪测定OD值来进行定量研究。此法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性实验、肿瘤放射敏感性实验等。27四唑盐（MTT）比色法的操作步骤单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200μl（96孔培养板每孔容积370μl），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间；加入2mg／ml的MTT液（50μl／孔）；继续培养3小时；吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150μl／孔），将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm），记录结果。28细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。29冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。30慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min当温度达-25℃以下时，5～10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。31低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO（二甲基亚砜），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。32细胞冻存方法1预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4年后，存活率可达80％一90％。DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。33细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。34细胞分离方法非酶消化法:1.直接分离法（机械法和EDTA螯合法）2.组织块培养法酶消化法:1.胰酶消化（条件较难掌握）2.胶原酶消化（两步灌流法）3.Dispase（中性蛋白酶）1.胰蛋白酶(Trypsin)●在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次