中国柑桔溃疡病菌遗传多样性分析及其防治药剂筛选

西南大学硕士学位论文中国柑桔溃疡病菌遗传多样性分析及其防治药剂筛选姓名：姚廷山申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：周常勇20090501中国柑桔溃疡病菌遗传多样性分析及其防治药剂筛选作者：姚廷山学位授予单位：西南大学相似文献(10条)1.会议论文朱木元.邱柱石.卢运胜.梁瑞郑三氯异氰尿酸防治柑桔溃疡病初探1998该文选用新型消毒杀菌剂三氯异氰尿酸，作为防治柑桔溃疡病的药剂。通过对该病原菌的抑菌试验及田间药效试验，证明三氯异氰尿酸对柑桔溃疡病原菌有强抑制作用和良好的防效（９７．３６℅），与常规农药代森铵防效（８４．５１℅）差异显著，和胶氨铜防效（５９．８９℅）差异达极显著。三氯异氰尿酸低毒，无致畸、致突变作用，在自然环境中分解为氨气和二氧化炭，因此无残留积累，不会污染环境，使用安全。2.学位论文赵云柑桔溃疡病的定量PCR检验检疫技术研究2006柑桔溃疡病(CitrusBacterialCankerDisease，CBCD)是严重危害世界柑桔种植业的一种细菌性病害，其病原物为地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种Xanthomonosaxonopodispv.citri(Xac)。CBCD广泛发生在世界各主要柑桔产区，包括亚洲、中东、非洲、太平洋和印度洋诸岛、澳大利亚、南美以及美国东南部的三十多个国家和地区均有不同程度的发生。我国的CBCD主要分布在福建、广东、广西、江西、浙江、湖南、湖北以及云、贵、川等南方柑桔种植区。该病能侵染绝大多数商业栽培品种，虽然很少会直接杀死寄主，但会导致落叶、落果、树势衰弱和果实生锈斑且品质变劣，严重降低了果品的经济价值。长期以来由于缺乏抗病品种和特效的化学防治药剂，对该病的防治主要采取加强非疫区建设与植物检疫来严防病害的传播，对病树采取挖除并集中烧毁的根除措施。柑桔非疫区建设的疫情监测和柑桔苗木、果品出入境检疫检验要求快速准确的诊断鉴定技术为支撑。传统上柑桔溃疡病的检测方法有常规检测法，包括典型症状目测法、组织病理切片法和病原菌分离培养及致病性测定法等。此外还有噬菌体检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)和斑点免疫结合法(DIA)。这些方法在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高的缺点，不能很好的满足检疫工作的要求。随着生物技术尤其是DNA重组技术的飞速发展，与植物致病性相关基因不断地被鉴定和克隆出来，许多重大疫病的诊断治疗己逐步进入分子水平。分子水平的检测具有快速、特异、灵敏的特点，可以满足现代植物检疫工作的要求。作为国内外重要的检疫性有害生物，近年来柑桔溃疡病菌的快速检测技术研究也取得了长足的进展。DNA杂交诊断法、DNA指纹图谱分析等方法特别是PCR检测技术的应用，使CBCD的检验检疫工作有了一种更加快速、准确、灵敏、便捷的快速检测方法。而荧光定量PCR(Realtime-PCR或FQ-PCR)作为更新的技术，与常规PCR相比，具有更高的检测灵敏度和特异性，不仅能更快速更准确的对病原物进行检测鉴定，无需凝胶电泳分析，避免EB等致癌危险试剂的使用，更环保安全，而且还能对带菌量进行定量分析。该项技术不仅可以在柑桔苗木与产品的口岸检验检疫及国际贸易争端中发挥重要作用，而且还可以用于柑桔溃疡病菌侵染过程中的流行学研究以及病害的预警监测。本研究的目的：在柑桔溃疡病常规PCR检测技术研究的基础上，建立起全新的具有实际应用价值的定量PCR检测技术方法，为柑桔溃疡病的快速准确鉴定以及病害监测预报提供技术支持。本研究的主要方法：根据柑桔溃疡病菌的全基因组序列，选择位于Xac染色体上的独有保守蛋白基因，运用引物设计软件设计筛选出分别用于SYBRGreenI染料和TaqMan探针RTi-PCR检测的特异性引物对及探针；进行保守蛋白基因扩增片段克隆，以重组质粒构建无害化标准阳性对照，用于定量检测；参照商业反应混合液，优化Mg2+浓度、引物浓度、热启动DNA聚合酶浓度、dNTP浓度、TaqMan探针及SYBRGreenI染料浓度等反应成分，优化PCR扩增程序，开发出低成本的自配定量PCR反应试剂；以柑桔叶片腐生非致病菌为对照，验证两种定量PCR方法的特异性，以10倍梯度稀释的Xac菌悬液和DNA溶液测试定量PCR检测技术的灵敏度；对四川、重庆、广西等地田间样品的实际检测，并对其中的部分样品进行分离培养和致病性测定以验证该检测技术的可靠性和准确性。最后成功建立了两种特异、准确的柑桔溃疡病菌RTi-PCR检测技术，对Xac细菌检测灵敏度达到1～5个细菌/25μL，对Xac靶片段DNA的检测灵敏度可达1～2fg/25μL，比常规PCR的灵敏度高出2～3个数量级。研制了能常温贮存的定量PCR检测试剂，并申请专利。3.期刊论文谭小艳.黄思良.任建国.晏卫红.岑贞陆.TANXiao-yan.HUANGSi-liang.RENJian-guo.YANWei-hong.CENZhen-lu柑桔溃疡病内生拮抗细菌Bc51的研究-植物病理学报2007,37(1)从中国南宁柑桔叶片中分离到对柑桔溃疡病菌有拮抗作用的细菌菌株Bc51.根据16SrDNA序列同源性、形态学特征和生理生化反应,将该菌株鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia).温度、pH值和培养基对洋葱伯克霍尔德氏菌抑制柑桔溃疡病菌生长的能力有显著影响.在温室测试中,观察到60.3%柑桔溃疡病斑的形成受到洋葱伯克霍尔德氏菌抑制.连续8次在人工培养基上转代培养,洋葱伯克霍尔德氏菌对柑桔溃疡病菌生长的抑制力没有发生明显改变.洋葱伯克霍尔德氏菌对植物病原菌有较宽的抑菌谱,表明除柑桔溃疡病外,该菌对其它作物病害的防治也具有潜在的应用价值.4.学位论文陈力柑桔溃疡病生防菌株枯草芽孢杆菌CQBS03的研究2007柑桔溃疡病(CitrusBacterialCankerDisease,CBCD)是严重危害世界柑桔种植业的一种细菌性病害，其病原物为地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种(Xanthomonasaxonopodispv.citri=Xanthomonascampestrispv.cirri，Xac)，是国内外重大检疫性有害生物。该病菌能侵染绝大多数商品化栽培柑桔品种，导致落叶、落果、树势衰弱和果实生锈斑且品质变劣，严重降低了果品的商品价值及产量。由于该病对柑桔产业的影响，在美国、巴西、澳大利亚、中国等大多数国家和地区的非疫区，对外来入侵的柑桔溃疡病采用挖树烧毁根除法，给这些国家和地区的经济带来了重大损失。而在病区，人们采取化学防治为主、农业防治为辅的综合防治策略，以控制病菌危害。但化学保护法也只能在一定程度上降低发病率，而且病原菌会对一些药物产生耐药性，并且使用化学农药对环境生态有污染，同时也不能满足人们对安全的要求。而用生物防治方法由于采用自然界本身存在的生物或其产物，很少会对环境产生影响，而且它们的毒性普遍也较低，不易在果实上残留，因而受到人们的广泛关注。本研究以从柑桔叶片上筛选出的对柑桔溃疡病菌有良好抑制作用并产生拮抗物质的拮抗细菌CQBS03为实验材料，对该菌的分类地位、抑菌活性与抑菌谱、最佳培养发酵条件、抑菌活性成分的特性进行了系统研究，并对抑菌活性物质进行了初步分离纯化，取得了以下研究结果：1)采用纸碟法进行的CQBS03菌株及其活性成分粗提物抑菌试验结果表明，拮抗细菌CQBS03的抑菌谱很广，对柑桔溃疡病菌、柑桔绿霉、芒果炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌以及腐生黄单胞杆菌等十几种植物病原菌都有较好的抑制效果，特别对于柑桔溃疡病菌有较强的抑菌效果，有着良好的应用前景。2)结合形态学、生理生化特性分析和16SrDNA序列分析结果对CQBS03菌株进行了种属鉴定，鉴定结果发现，该菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)有99％的同源性，生理生化特性等也与典型的枯草芽孢杆菌相一致，且二者在系统发育树中处于同一个分支，最终确定CQBS03应该属于枯草芽孢杆菌B.subtilis的一个菌株。3)通过单因素实验和正交设计实验筛选优化了CQBS03菌株的最佳培养发酵条件。最适培养基为YPG液体培养基，产抑菌物质的最适培养条件为：发酵培养温度28℃，初始pH8.0，摇瓶装液量1/5体积，接种量5％，摇床转速250r/min，发酵周期72h。4)利用饱和硫酸铵盐析，获得抑菌活性成分粗提物。该粗提物70℃处理30min后，活性显著下降，100℃处理30min后则完全失活，表明其不耐高温；抑菌活性成分对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感，对氯仿敏感，分子量大于10kDa，等电点(pI)为5左右。初步认定此抑菌活性成分为蛋白质类物质，5)采用抑菌活性检测和SDS-PAGE跟踪检测，通过盐析结合疏水层析方法从COBS03的发酵液中初步分离纯化到一抗菌蛋白，通过SDS-PAGE电泳分析，该抗菌蛋白的分子量在55kDa左右。5.期刊论文黄青春.周明国.叶钟音柑桔溃疡病菌胞外产物在拌种灵与菌体互作中的作用-植物病理学报2001,31(2)柑桔溃疡病原细菌的胞外产物,在拌种灵与病原菌互作过程中具有一定的调控作用.胞外产物尤其是胞外粘多糖(EPS),对拌种灵具有很强的拮抗作用;经药剂处理的病原菌,其胞外产物如:电解质、EPS、胞外蛋白、以及胞外水解酶等,其产量和生物活性都呈现出一定规律的变化.研究表明,病原菌在药剂处理下,可通过胞外产物的变化产生一定的抗逆反应.6.学位论文巢进利用拮抗菌对柑桔溃疡病的生物防治研究2005本研究通过在衡阳、永州等地采回柑桔溃疡病样本进行柑桔溃疡病病原菌分类分离。结果表明采取新叶片病斑用酒精消毒7-10秒就可以有效的分离到该病原物。　　同时从衡阳、永州、常德、长沙等地的病园或非病园中采集不同的柑桔品种叶片及果实，对标本表面微生物进行了分离和对柑桔溃疡病病菌的拮抗筛选。总共分离到234个菌株，其中细菌菌株225个，真菌菌株9个。从中筛选出Kx15,Kx22,Kx47,Kx48等32个菌株对Xanthomonasaxonopodispv.citri的生长有抑制作用。其中以Kx15,Kx22，Kx47,Kx48效果最佳。通过对菌株过滤液拮抗作用和定殖力的测定，Kx47菌株的过滤液无拮抗作用，而菌株Kx22的在柑桔叶面定殖力差，故将菌株Kx15、Kx48定为此次研究的目标生防菌。7.期刊论文黄青春.周明国.叶钟音柑桔溃疡病菌抗药突变体的生理特性研究-植物病理学报2003,33(1)经药剂驯化和紫外光诱导双重作用可获得柑桔溃疡病菌抗拌种灵突变体(XcR),病原菌抗药突变频率低于10-6.XcR的生长速率与敏感菌株基本一致,对萎锈灵和叶枯唑具有潜在的正交互抗性,与浸种灵没有交互抗性.XcR胞外产物和胞外水解酶活性一般多于或高于敏感菌株,其中以淀粉酶活性变化最为明显.XcR琥珀酸脱氢酶活性显著降低,并对拌种灵的敏感性亦降低.XcR能够引起烟草的过敏性反应,但失去对寄主的致病性.XcR的性质表明,柑桔溃疡病菌对拌种灵产生抗药性的风险较低,病原菌获得抗药性状的同时可能导致其在田间的适合度下降.琥珀酸脱氢酶的活性可作为柑桔溃疡病菌抗药性的标记.8.学位论文袁青柑橘溃疡病菌重组单链抗体研究2007基因工程重组单克隆抗体(recombinationmonoclonalantibody，RMA)是90年代以来，人们利用基因工程重组技术，有目的地在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰，或者直接合成基因序列，再将重组DNA或重组蛋白基因导入细胞表达产生的一类抗体，其化学结构特点与单克隆抗体相同，具有稳定的免疫特异性。其中单链抗体(singechainvariablefragment，ScFv)由于低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强，成本低，可大规模生产等特点已广泛应用于医学领域。单链抗体可以通过噬菌体展示技术或核糖体展示技术加以制备。其中，核糖体展示技术完全在体外进行，其库容量远远大于噬菌体展示文库，此外核糖体展示技术简便的建库和筛选方法，勿需选择压力，通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点都使核糖体展示技术显示出了诱人的发展前景。国内外关于植物病