随机引物标记探针

1第二节分子杂交及相关技术分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。2双链probe或DNA解链，主要取决于：1．链的长度：链越长，需要的能量多才能解链；2．碱基成分：GC含量高，较难变性；3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链3一、杂交探针的获得是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。4（一）制备特异性探针所需要的基本条件1.被检基因结构清楚；2.有明确的基因产物;3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。5（二）特异探针的来源1、基因组探针：从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。克隆扩增大量的DNA探针6DNA克隆72、cDNAprobe:从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。83、寡核苷酸探针克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约15～50个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。9二、探针的标记将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物：同位素：32P,35S,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。常用的标记方法：101、缺口平移法（NickTranslation）原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。11NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP122、随机引物法（6核苷酸引物标记法）原理及过程：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→3’聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’→5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。13随机引物标记探针5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP变性-复姓14一、DNA杂交常用的方法（一）.Southernblot1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。1、原理和步骤:提取T、CellDNA限制酶消化DNA片段电泳分离变性转移至尼龙膜变性、杂交洗膜、放射自显影、结果分析15SouthernBlot162、应用:(1)基因组结构分析：如缺失、插入、倒位等的检测(2)RFLP连锁分析17(二).斑点杂交(dotandslothybridization)鉴定核酸序列的简便方法。1、原理及步骤：提取T、CellDNA↓点样品至膜、干燥、固定↓探针、DNA变性、杂交↓洗膜、放射自显影↓结果分析18DNA样品2、应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析点样Probe-32P检测AB123419（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，ASO）该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成ASO探针。探针通常为20bp左右，标记后用于杂交检测。检测点突变时一般需合成两种探针：设计：正常探针5’-AGT-3’与正常基因序列杂交稳定而不与突变基因杂交；突变探针5’-AAT-3’与突变基因序列杂交稳定而不与正常基因杂交；PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后的产物——突变基因检测。20例:PKU产前诊断正常探针突变探针12ⅠⅡ12Ⅱ2进行产前基因诊断结果分析Ⅱ2为正常个体21四、Northernblot是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基因探针分析基因的转录水平。1、原理及步骤：提取T、Cell总RNA↓提纯分离mRNA↓琼脂糖凝胶电泳分离RNA↓转移至硝酸纤维素膜↓杂交检测22NortherBlot232、应用：（1）.检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；（2）.mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）24五、Westernblot是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。原理及步骤：Torcell↓提取蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白（SDS-PAGE）↓转移（印迹）于硝酸纤维素膜↓加抗体检测某种特异性蛋白质25WestBlot