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第十九章生物技术药物制剂大纲要求掌握：生物技术的基本概念，生物技术药物的结构特点与理化性质，蛋白质类药物的一般处方组成，液体剂型中蛋白质类药物的稳定化熟悉:固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺了解：生物技术药物的研究概况，非注射给药系统，新型注射(植入)给药系统一、生物技术的基本概念（掌握）生物技术或称生物工程是应用生物体（包括微生物、动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术现代生物技术主要包括基因工程、细胞工程与酶工程，此外还有发酵工程（微生物工程）与生化工程生物技术药物是指采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品。采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，也称为生物技术药物近十几年来，生物技术在医药方面取得了惊人的成就，已有不少生物技术药物应用于临床二、生物技术药物的研究概况（了解）目前国内外已批准上市的生物技术药物产品约40余种，见表19-1正在研究的有数百种之多，部分正在研究的生物技术或其他来源的药物列于表19-2中，这些药物均属肽类与蛋白质类药物随着生物技术药物的发展，肽和蛋白质药物制剂的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域也给药物制剂带来了新的挑战挑战①生物技术产品多为多肽和蛋白质类，性质很不稳定，极易变质—稳定性②这类药物对酶敏感又不易穿透胃肠粘膜，故只能注射给药，使用很不方便——顺应性运用制剂手段将这类药物制成口服制剂或通过其他途径给药，以提高其稳定性和患者使用的顺应性，是一项非常有意义的工作，具有潜在的研究价值和广阔的应用前景三、生物技术药物的结构特点与理化性质（一）蛋白质的结构特点1．蛋白质的组成和一般结构蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键相连而成的多肽链蛋白质分子量很大，一般在5×103~5×106蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成、氨基酸排列顺序、肽链数目、末端组成和二硫键的位置等组成蛋白质的氨基酸有20多种肽、多肽、肽键、氨基酸序列蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置；二、三、四级结构为高级结构或空间结构高级结构和二硫键对蛋白质的生物活性有重要影响2．蛋白质的高级结构二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有螺旋结构与折叠形式三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合方式系一条多肽链中所有原子的空间排布四级结构是指具有三级结构的蛋白质各亚基聚合而成的大分子蛋白质蛋白质高级结构示意图蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象时才有生物活性形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力、离子键、范德华力、二硫键与配位键。除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力（二）蛋白质的理化性质1．蛋白质的一般理化性质蛋白质的分子量蛋白质在水中形成亲水胶体，颗粒大小在lnm~100nm之间它不能透过半透膜由于蛋白质分子中存在极性基团如-NH3+、-COO-、-NH2、-OH、-SH等，可形成水化层而稳定（1）旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大（2）紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收（3）蛋白质两性本质与电学性质蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，如赖氨酸的-氨基，谷氨酸的γ羧基等。这些基团在一定pH条件下都能发生解离而带电因此蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下蛋白质会成为阳离子、阴离子或二性离子2．蛋白质的不稳定性（1）由于共价键引起的不稳定性蛋白质的降解途径：共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解、氧化、消旋化和二硫键的断裂与交换(蛋白质的特有反应)，有时几种反应同时进行蛋白质稳定性监测数据表明其降解过程不符合Arrhenius关系，故蛋白质类药物稳定性的加速实验中应慎重选择其最高温度蛋白质的稳定性对于蛋白质类药物的制剂研究、生产、贮存等极为重要1）蛋白质的水解蛋白质可被酸、碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量逐渐变小，成为分子量大小不等的肽段和氨基酸完全水解是在5.7mol／L盐酸中，于110℃高温20h可完全变成氨基酸不完全水解是在酶或稀酸等较温和的条件下进行，水解产物有肽段与氨基酸蛋白质在4.2mol/LNaOH溶液中水解10h，使蛋白质完全水解，碱水解对半脱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸等有破坏作用，同时使各种氨基酸发生消旋2）蛋白质的氧化蛋白质中具有芳香侧链的氨基酸，如甲硫氨酸、半胱氨酸可以在一些氧化剂的作用下氧化，而使一些多肽类激素和蛋白质失去活性影响氧化的因素有温度、pH值、缓冲介质、催化剂的种类和氧的强度等巯基的氧化在碱性条件下，特别是在金属离子（如Cu2+）的存在下容易发生3）外消旋作用某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生转移，使D-或L-型化合物转变为D-型和L-型各50％的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH值、离子强度和金属离子螯合作用蛋白质中氨基酸的消旋作用一般能使氨基酸成为非代谢的形式4）二硫键断裂及其交换二硫键（-S-S-）又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化学键它是由两个半胱氨酸侧链上的-SH巯基脱氢相连而成二硫键把同一肽链（肽链内）或不同肽链（肽链间）的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用在某些蛋白质中，二硫键一旦破坏，蛋白质的生物活性即丧失，蛋白质分子中二硫键数目愈多，则结构稳定性和抗拒外界因素的能力也愈强蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响其生物活性（2）由非共价键引起的不稳定性引起蛋白质不可逆失活作用的下列主要类型，即聚集、宏观沉淀、表面吸附与蛋白质变性这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起这些现象在开发蛋白质与多肽类药物制剂中常会带来许多困难（三）蛋白质类药物的评价方法1．液相色谱法液相色谱法是评价蛋白质的纯度与稳定性的常用方法在蛋白质分析中通常采用：I.反相高效液相色谱法（RP-HPLC）II.离子交换色谱法（IEC）III.分子排阻色谱法（Sizeexclusionchromatography，SEC）反相高效液相色谱法（RP-HPLC）固定相应有较宽范围的孔体积（直径约300nm或更大）流动相一般用不同浓度的乙腈水溶液，并含有离子对试剂应用反相HPLC法会使一些蛋白质变性广泛应用于胰岛素制剂的质量分析2．光谱法用于评价蛋白质药物的光谱方法有紫外（UV）、可见吸收光谱、旋光色散（ORD）、圆二色谱（CD）、荧光、红外（IR）和拉曼（Raman）光谱紫外吸收常用于测定溶液中蛋白质的浓度光散射可测定制剂中蛋白质的聚集数量蛋白质的远紫外圆二色谱直接反映蛋白质的二级结构3．电泳电泳技术是根据在电场的作用下，蛋白质在载体凝胶上产生特征性迁移，迁移率是所带净电荷及其大小的函数，以此来分离混合蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电点聚焦（isoclectricfocusing，IEF）和新的毛细管电泳（EC）法本法用于测定蛋白质亚单位组成和分子量，可取得满意效果4．生物活性测定与免疫测定蛋白质药物制剂的稳定性也应检测其生物活性生物活性检测是利用体内模型或体外组织或活性蛋白质多肽的特异性生物学反应，通过剂量（或浓度）效应曲线进行定量生物活性测定是制订这类药物制剂质量标准的最基本方法免疫测定免疫测定通常是采用免疫化学法这种建立在沉淀反应基础上的免疫化学方法非常适合于蛋白质的定性及定量分析、蛋白质制剂（混杂有其它蛋白质）的均一性试验以及蛋白质混合物组分的鉴定与其它方法相比较，主要优点是可用于定量化学分析不能检测的情况，例如测定蛋白质混合物的一种组分第二节蛋白质类药物制剂的处方与工艺蛋白质类药物制剂的研制关键是解决这类药物的稳定性问题对于注射给药则采用适当的辅料，设计合理的处方与工艺而非注射给药还需解决生物利用度问题一、蛋白质类药物的一般处方组成目前临床上应用的蛋白质类药物注射剂，一类为溶液型注射剂，另一类是冻干粉注射剂溶液型使用方便，但需在低温（2~8℃）下保存冻干粉型比较稳定，但工艺较为复杂二、液体剂型中蛋白质类药物的稳定化在液体剂型中蛋白质类药物的稳定化方法分为两类：①改造其结构（该方法不属于制剂学范畴）②加入适宜辅料：通过加入各类辅料，改变蛋白类蛋白类药物的稳定剂1．缓冲液蛋白质的物理化学稳定性与pH值有关，采用适当的缓冲系统将pH值维持在蛋白质能够稳定的一个很窄的范围不同的蛋白质，其稳定的pH值范围不同缓冲盐类除了影响蛋白质的稳定性外，其浓度对蛋白质的溶解度与聚集均有很大影响2．表面活性剂在蛋白质药物的制剂中加入少量非离子表面活性剂能抑制蛋白质的聚集机理可能是因为表面活性剂倾向于排列在气—液界面上，从而使蛋白质离开界面来抑制蛋白质的变性离子型表面活性剂会引起蛋白质的变性3．糖和多元醇糖和多元醇属于非特异性蛋白质稳定剂蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇（浓度1%~10%）最常用糖和多元醇的稳定作用与其浓度密切相关不同糖和多元醇的稳定程度取决于蛋白质的种类还原糖与氨基酸有相互作用，因此避免使用4．盐类盐可以起到稳定蛋白质的作用，有时也可以破坏蛋白质的稳定性主要取决于盐的种类、浓度、离子相互作用的性质及蛋白质的电荷5．聚乙二醇类高浓度的聚乙二醇类常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀结晶剂研究表明不同分子量的PEG作用不同，如PEG300浓度0.5%或2%可抑制重组人角化细胞生长因子（rhKGF）的聚集；PEG200、400、600和1000可稳定BSA和溶菌酶6．大分子化合物研究表明很多大分子化合物具有稳定蛋白质的作用其机制可能是通过大分子的表面活性、蛋白质-蛋白质相互作用的空间隐蔽以及提高粘度来限制蛋白质运动或通过优先吸附于大分子以起到稳定作用人血清白蛋白（HAS）已在许多蛋白质类生物技术来源的药物制剂中作稳定剂2-羟丙基--环糊精是较有前途的稳定剂，其本身又是增溶剂可静脉注射，可用来抑制hGH的界面变性，抑制rhKGF的聚集，稳定白介素-2和牛胰岛素等7．组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等可不同程度地抑制45℃10mM磷酸盐缓冲液中rhKGF的聚集8．金属离子一些金属离子，如钙、镁、锌与蛋白质结合，使整个蛋白质结构更加紧密、结实、稳定不同金属离子的稳定作用视离子的种类、浓度不同而不同，应通过稳定性实验选择金属离子的种类和浓度三、固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺（熟悉）（一）冷冻干燥蛋白质药物制剂问题：一是选择适宜的辅料，优化蛋白质药物在干燥状态下的长期稳定性二是考虑辅料对冷冻干燥过程中一些参数的影响，如最高与最低干燥温度，干燥时间，冷冻干燥产品的外观等在一些蛋白质药物不能采用溶液型制剂时，往往用冷冻干燥与喷雾干燥的工艺使形成固体状态以提高这类制剂的稳定性有些蛋白质药物在冻干过程中反而失去活性的主要原因①从液态到固态的相变过程中，包在蛋白质周围的水分子被除去而失活②高浓度的盐和缓冲组分的结晶或缓冲液pKa对温度敏感而导致pH变化、浓缩时蛋白质有限的溶解度等均能导致蛋白质药物失活在选择冻干制剂的缓冲体系时，要考虑到温度对pH值和溶解度的影响在蛋白质类药物冻干过程中常加入某些冻干保护剂来改善产品的外观和稳定性，如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐等在冻干过程中控制好制剂的冷冻温度、有可能使饼状物熔化或坍塌的温度及有可能使产品发