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LncRNA研究策略1non-codingRNA(20-20000nt)RNAmRNAsmallnon-codingRNA(sncRNA)(20-200nt)longnon-codingRNA(lncRNA)(200-20000nt)LncRNA是RNA聚合酶II转录的产物，具有polyA尾结构；不编码蛋白；物种间不保守；通常位于核内；LncRNA(longnon-codingRNA)简介2LncRNA已知功能1)在编码蛋白基因的上游启动子区（橘色）转录，从而干扰邻近蛋白编码基因（蓝色）的表达2)抑制RNA聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，而影响基因（蓝色）表达；3)lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，进而产生不同的剪切形式；4)lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平；5)lncRNA（绿色）结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；6)作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7)结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位；8)可作为小分子RNA（如miRNA）的前体分子或者miRNA的反义抑制分子。图 lncRNA的八种作用方式机制切入点：抑制基因表达；引导DNA-蛋白结合；染色质重构，表观调控Wilusz et al. Genes Dev. 2009. 23: 1494-1504. PMID: 19571179. 3LncRNA医学基础研究策略临床/动物实验样本收集差异LncRNA筛选目标LncRNA确定LncRNA功能验证LncRNA机制研究（靶点抑制型研究）Gain of FunctionLoss of FunctionmRNAmiRNAProtein（RNA pull dwon）汉恒强项品质保证4RIP, RNA pulldown…•miRNA和lncRNA高表达•共定位在细胞质•Northern blot, FISHLncRNA作用蛋白预测RBPDB数据库（）LncRNA预测miRNA预测miRNA预测miRNA(2011).AlongnoncodingRNAcontrolsmuscledifferentiationbyfunctioningasacompetingendogenousRNA.Cell147(2):358-369.LncRNA竞争内源miRNA的例子2.信息学预测和Linc-MD1结合的miRNA有36个，排除肌肉发育不相关的，只剩下miR-135和miR-133两个。3.证明之后通过文献阅读查找这两个miRNA的靶基因：一定要和肌肉发育相关—MEF2C和MAML1。4.证明Linc-MD1与MEF2C和MAML1表达的正调控相关性。1.表达分析鉴定出Linc-MD1参与肌肉发育调控。8汉恒HBcirc-EnhancedTMcircRNA环化系统环状RNA（circRNA）研究概述9环状RNA研究趋势国自然中标数量-急剧增长国际发文数量-缓慢增长环状RNA(CircularRNAs,circRNA)Chen,L.L.andL.Yang(2015).RegulationofcircRNAbiogenesis.RNABiology12(4):381-388.Ø不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴Ø共价键形成环形结构，核酸酶不敏感Ø大部分circRNA是由外显子构成，进化保守Ø时空表达特异性11ØcircRNA竞争性内源RNA(competingendogenousRNA，ceRNA)，与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵的作用circRNA的功能---竞争性内源RNAMemczak,S.,etal.(2013).CircularRNAsarealargeclassofanimalRNAswithregulatorypotency.Nature495(7441):333-338.circRNACDR1结合miR-7，影响斑马鱼中脑发育12Ø含内含子序列的环状RNA(ciRNA)一般常驻细胞核内，调节基因的转录。circRNA的功能---调控基因转录Ø来源于ANKRD52基因第二个内含子区域的circRNAci-ankrd52依赖于和该基因共同的RNA序列。ci-ankrd52主要在细胞核中积累，并促进RNAPolII对ANKRD52基因的转录。Zhang,Y.,etal.(2013).CircularintroniclongnoncodingRNAs.MolecularCell51(6):792-806.13ØcANRIL与INK4/ARF的转录和心血管硬化疾病风险相关Ø黄胜林团队发现外泌体中circRNA与肿瘤的发生发展相关circRNA的功能---疾病markerLi,Y.,etal.(2015).CircularRNAisenrichedandstableinexosomes:apromisingbiomarkerforcancerdiagnosis.CellResearch25(8):981-984.Burd,C.E.,etal.(2010).ExpressionoflinearandnovelcircularformsofanINK4/ARF-associatednon-codingRNAcorrelateswithatherosclerosisrisk.PLoSGenetics6(12):e1001233.14circRNA的研究套路二代测序/芯片数据库构建过表达环化载体（Gainoffunction）circRNA的敲减（Lossoffunction）转（感）染目的细胞或组织表型/功能验证调控机制做到表型功能验证就基本可以写文章投稿了。机制的挖掘难度较大，属于大文章专用。15•领域第一篇circRNA研究•表达水平的验证•结合表型，在细胞/动物模型验证功能•机制：优先考虑ceRNANameDescriptionLinkdeepBase包含了大约15万的circRNA基因（人、鼠、果蝇、线虫等），构建了最全面的circRNA的表达图谱！经常无法访问！（坑爹）相互作用网络数据库公共数据库，汇集大量已知或未知功能的circRNA数据（RNA-seq数据等）功能数据库，汇集于circRNA相关的疾病及表征形状数据。经常无法访问！（坑爹）研究的常用数据库16环状RNA名称基因17CDR1as基因名称18circRNA的研究套路二代测序/芯片数据库构建过表达环化载体（Gainoffunction）circRNA的敲减（Lossoffunction）转（感）染目的细胞或组织表型/功能验证调控机制19•领域第一篇circRNA研究•表达水平的验证•结合表型，在细胞/动物模型验证功能•机制：优先考虑ceRNA你在这儿！汉恒自主研发的超强成环系统体内转录剪接环化成环汉恒HBcirc-EnhancedTMcircRNA环化系统20汉恒HBcirc-EnhancedTMcircRNA研究工具载体慢病毒：建立细胞稳转系专用腺病毒：适用于所有的细胞系腺相关病毒：动物在体研究专用汉恒生物提供的服务Ø二代测序和芯片ØcircRNA过表达服务Ø反向PCR、测序验证ØRT-PCR(qPCR)验证ØcircRNA敲减实验ØcircRNA的敲除21谢谢大家！欢迎交流！22