中药“增免散”对鸡免疫功能影响的研究

中药“增免散”对鸡免疫功能影响的研究姜国均1，2郭红斌1刘宗平2∗（1.扬州大学兽医学院，扬州，225009；2.河北农业大学中兽医学院，定州，073000；）摘要：将300只1日龄雏鸡随机分成对照组、中药“增免散”组、环磷酰胺组、环磷酰胺+左旋咪唑组、环磷酰胺+“增免散”组，6日龄用鸡新城疫LaSota疫苗免疫，14、21、28、35日龄检测“增免散”对鸡体液免疫功能和红细胞免疫功能的影响，探索中药“增免散”的免疫增强机理。结果表明：中药“增免散”能显著升高雏鸡外周血B淋巴细胞EAC(erythrocyte-antibody-Complement)花环率，对雏鸡红细胞免疫粘附功能具有显著促进作用，而且对环磷酰胺的免疫抑制有一定拮抗作用。关键词：鸡，中药，增免散，免疫功能StudiesoftheEffectof“ZengMianSan”onimmunefunctioninchickenJiangGuo-jun1，2GuoHong-bin1LiuZong-ping2*(1.Collegeofveterinarymedicine,UniversityofYangZhou;YangZhou,Jiangshu,225009；2.CollegeofTraditionalChineseveterinarymedicine,AgriculturalUniversityofHebei，Dingzhou，073000；)Abstract:300one-dayoldchickenswererandomlydividedintofivegroups,i.e.,thecontrolgroup,Chineseherbalmedicine“Zengmiansan”(ZMS)group,Cyclophosphamidegroup,Cyclophosphamide+LevamisoleandCycolphosphamide+ZMSgroup.AllchickenswereimmunizedwithLaSotaonthesixdayold,thentheEAC(erythrocyte-antibody-Complement)ratioofperipheralbloodlymphocytes,theerythrocyteC3bRratioandICratiowereobservedatthe7,14,28,35-dayoldchicken,toexplorethemechanismoftheChineseherbalmedicine“ZMS”howtoincreasetheimmunity.TheresultsindicatedthattheEACratioofperipheralbloodlymphocytesanderythrocyteC3bRratiowereincreasedmarkedlyandICratiodecreasedmarkedlyinZMSgroupscomparedwithcontrolgroup.Keywords:Chinesetraditionalmedicine;ZengMianSan;immunefunction;chicken目前，尽管在养禽生产中对许多传染性疾病采用相应的疫苗进行预防，但由于病原种类极其复杂，而且不断产生变异，使疫苗的研制往往滞后于疫病的发生，单纯依赖疫苗不能解决疫病的防制问题。解决家禽疫病防制问题应从提高家禽的内在免疫机能入手，通过增强其自身的抗病能力，达到预防疫病的目的。“增免散”(Zengmiansan，ZMS)是由河北农业大学中兽医学院，经过多年研究出的具有增强鸡免疫功能的纯中药制剂，由黄芪、何首乌、羊红膻、贯众、常山、青蒿、神曲等组成。研究表明[1~3]，中药“增免散”能促进免疫器官的发育，促进T淋巴细胞的分化和成熟，提高外周血液中CD4+/CD8+Ｔ淋巴细胞百分比，促进机体鸡新城疫抗体的产生等。此次试验以环磷酰胺（Cyclophosphamide，Cy）为免疫抑制模型，以左旋咪唑(Levamisole，LMS)为免疫增强模型，通过研究它们对B淋巴细胞和红细胞免疫功能的影响，旨在进一步证实“增免散”的免疫增强作用，为“增免散”的临床应用提供试验依据。1材料与方法基金项目：河北省畜牧局科技攻关项目（2003-11）作者简介：姜国均（1971-），汉族，博士生。联系电话：[phone]∗通讯作者，刘宗平，博士生导师，教授。研究方向：临床兽医学。E-mail:[e-mail]1.1中药制剂的制备“增免散”煎剂，由黄芪、羊红膻、何首乌、贯众、青蒿、常山、神曲按一定比例构成，采用煎煮法制备原药水煎剂，煎剂过滤去渣，加热浓缩至每毫升含生药1g，装瓶，高压灭菌，4℃保存。中药材购自河北省定州市药材公司。1.2试验动物的分组及处理300只1日龄海兰褐雏鸡购自定州市种鸡场，随机分成5组，每组60只（设Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ组为中药ZMS组，Ⅲ组为Cy组，Ⅳ组为LMS+Cy组，Ⅴ组为ZMS+Cy组）。喂全价饲料，饲养至6日龄，用新城疫LaSota疫苗免疫点眼滴鼻，7日龄，Ⅱ、Ⅴ灌服ZMS（2mL/kg），Ⅳ组灌服LMS（10mg/kg），Ⅰ、Ⅲ组灌服常水作对照，均连续一周；10日龄，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组肌肉注射Cy（80mg/kg），Ⅰ、Ⅱ组肌肉注射等量无菌生理盐水，均连续3天。试验期间采用笼养，鸡自由采食和饮水，1~14日龄采用红外灯保温，全日制光照。1.3试验药品环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份公司生产；盐酸左旋咪唑，江苏国营淮安制药厂生产；酵母多糖试剂由上海长海医院免疫室提供。1.4检测方法于14、21、28和35日龄，每组随机抽取接近鸡10只，编号，称重，心脏采血（2mL加抗凝剂，2mL不加抗凝剂），备用。1.4.1体液免疫功能的测定取上述抗凝血，按文献[4]方法做B淋巴细胞EAC(erythrocyte-antibody-Complement)花环试验，测定EAC花环形成率(%)。1.4.2红细胞(RBC)免疫粘附功能的测定取上述抗凝血，按郭峰法[5]做红细胞C3b受体花环试验和免疫复合物(IC)花环试验，测定C3bR花环率(%)和IC花环率(%)。1.5统计方法试验数据用SPASS10.0软件进行处理。2试验结果2.1“增免散”对体液免疫功能的影响14日龄，Ⅱ组EAC花环形成率高于其它各组，Ⅲ组EAC花环形成率低于其它各组，差异极显著(P0.01)；21日龄，Ⅱ组EAC花环形成率高于其它各组，Ⅲ组EAC花环形成率低于其它Ⅰ和Ⅱ组，差异极显著(P0.01)；28日龄，Ⅱ组EAC花环形成率高于其它各组，差异极显著(P0.01)；35日龄，各组EAC花环形成率相近，差异不显著(P0.05)。结果见表1。表1试验雏鸡的EAC花环形成率测定结果%组别14d21d28d35dⅠ16.24+0.74B18.36+1.02B17.56+1.02B19.33+1.15aⅡ22.56+1.86A30.59+3.75A25.59+3.75A20.16+1.86aⅢ10.56+1.86D13.59+3.75C15.23+3.75B17.97+2.91aⅣ13.17+1.04C16.28+1.63BC16.28+1.63B18.42+3.26aⅤ13.65+2.14C16.39+1.63BC16.59+3.75B18.79+1.63a2.2“增免散”对雏鸡红细胞免疫粘附功能的影响2.2.1“增免散”对雏鸡红细胞C3b受体花环率的影响14、21、28日龄，Ⅱ组C3b受体花环率高于其它各组，差异显著(P0.01或P0.05)；Ⅲ组C3b受体花环率低于其它各组，差异显著(P0.01或P0.05)。结果见表2。表2试验雏鸡红细胞C3b受体花环率的测定结果%组别14d21d28d35dⅠ6.22+1.04Ab10.31+2.18Ab15.27+3.07b16.25+2.73aⅡ7.52+2.01Aa12.64+2.34Aa18.13+3.51a17.57+1.29aⅢ3.16+1.29B7.32+1.27B11.32+3.65c15.49+3.58aⅣ5.09+1.61Ac9.02+2.01Ac13.76+2.38b16.19+2.84aⅤ5.87+1.81Ac9.96+1.07Ac14.35+1.12b16.76+2.31a2.2.2“增免散”对雏鸡红细胞IC花环率的影响14、21日龄，Ⅱ组鸡红细胞IC花环率低于其它各组，差异显著(P0.01或P0.05)；14、21、28日龄，Ⅲ组IC花环率高于其它各组，差异极显著(P0.01)。30日龄，各组IC花环率相近，差异不显著(P0.05)。结果见表3。表3试验雏鸡红细胞IC花环率的测定结果%组别14d21d28d35dⅠ5.75+1.24Bc7.76+1.87Bc9.02+2.19c9.46+2.11aⅡ3.82+1.85C5.52+1.68C8.23+3.24c9.19+2.43aⅢ10.78+1.37A13.16+1.38A13.57+2.16A11.79+3.61aⅣ6.19+1.93Bb9.39+2.01Bb10.58+2.82b10.71+3.72aⅤ6.02+1.27Bb9.03+1.65Bb10.09+0.61b10.54+1.69a3讨论“增免散”由黄芪、何首乌、羊红膻、贯众、常山、青蒿、神曲等组成。现代研究认为，黄芪、何首乌、羊红膻等具有免疫增强作用，贯众、常山、青蒿具有抑制病毒繁殖作用，神曲具有助消化、提高机体免疫力作用。本试验重点观察了“增免散”对鸡体液免疫功能和红细胞免疫功能的影响。3.1“增免散”对鸡体液免疫功能的影响EAC花环试验是体外检测B淋巴细胞质量的一种方法，通过EAC花环率可判定B淋巴细胞的功能，并可间接反映出机体的体液免疫状态[6]。试验发现，14日龄，Ⅱ组EAC花环形成率高于其它各组，Ⅲ组EAC花环形成率低于其它各组，差异极显著(P0.01)；21日龄，Ⅱ组EAC花环形成率高于其它各组，Ⅲ组EAC花环形成率低于其它Ⅰ和Ⅱ组，差异极显著(P0.01)；28日龄，Ⅱ组EAC花环形成率高于其它各组，差异极显著(P0.01)；35日龄，各组EAC花环形成率相近，差异不显著(P0.05)。表明该浓度的“增免散”在用药三周内能促进雏鸡B淋巴细胞的生长和成熟，能促进新城疫疫苗免疫雏鸡的体液免疫功能，并对环磷酰胺的抑制有一定拮抗作用，且能促进免疫抑制鸡体液免疫功能的迅速恢复。3.2“增免散”对鸡红细胞免疫功能的影响近年来，现代免疫学发展迅速，其研究领域已深入到分子和基因水平，使人们对免疫系统又有了更深层次的认识。Ｓiegel等[7]首次提出了“红细胞免疫系统”的新概念，认为红细胞除了运输氧、参与细胞呼吸外，还参与免疫功能。并认为体内清除CIC起主要作用的不是白细胞而是红细胞。1986年Schifferli[8]等提出CIC在体内的清除模式：红细胞膜上具有黏附活性的C3ｂ受体(CR1)，免疫复合物形成后进入循环，激活补体，通过CR1与红细胞发生免疫黏附(RCIA)，形成红细胞免疫复合物(RBC-CIC)，随血液达到固定吞噬系统(FMS)，FMS中的MΦ捕获与红细胞结合CIC并将其吞噬，而红细胞本身不被破坏，再度进入循环发挥RCIA作用。红细胞CR1还可以增强吞噬细胞的吞噬功能，对体内产生的各种变异细胞作出相应的免疫应答反应，通过红细胞表面的CR1对癌细胞及侵入人体内细菌、病毒起免疫黏附作用，这些被黏附的癌细胞、细菌、病毒可很快被吞噬细胞破坏[9]。判断红细胞免疫功能的主要指标为CR1活性，目前通常用酵母菌花环试验测定红细胞膜上CR1活性。从表2和表3可见，14、21、28日龄，Ⅱ组C3b受体花环率高于其它各组，差异显著(P0.01或P0.05)；Ⅲ组C3b受体花环率低于其它各组，差异显著(P0.01或P0.05)。14、21日龄，Ⅱ组鸡红细胞IC花环率低于其它各组，差异显著(P0.01或P0.