肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法

1第四章肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法2˙恶性肿瘤——常见病、多发病˙全世界每年700万死亡；占欧美死亡第二位˙我国城市居民第一位，农村第三位˙恶性肿瘤人类健康重要——杀手进展较大,疑难问题很多。肿瘤动物模型和抗肿瘤研究方法具有重要意义。34肿瘤动物模型可分为三类：自发性肿瘤动物模型诱发性肿瘤动物模型移植性肿瘤动物模型5第一节自发性肿瘤动物模型(animalmodelofspontaneoustumors)概念:未经人为处理；自然发生•自发性乳腺癌模型•自发性白血病模型6一、自发性乳腺癌模型生长在体表,易早期发现,罕有自发消退,因而能准确观察其大小与生长速度,便于进行实验。7现介绍三种自发性乳腺癌小鼠模型C3H小鼠：繁殖用雌鼠自发性乳腺癌发生率为85%~100%。A系小鼠：经产雌鼠乳腺肿瘤发生率为30%~80%。CBA小鼠：雌鼠自发性乳腺癌发生率为60%~65%。8在乳腺左右两侧及乳头部均可发生肿瘤。每只小鼠常见1个以上肿瘤。选择肿瘤数目和大小相近的动物,配对分组,给予受试药,观察受试药对肿瘤发展的影响。给药方案和给药途径可根据受试药物的特点确定。因自发性乳腺癌发展较缓慢，故采用间歇给药或小剂量连续给药较为合适。9[结果判定]给药后每天观察肿瘤生长情况，记录发生时间和位置。肿瘤结节长到一定程度,每周用脚规测量皮下肿瘤2次。测定肿块的最大径(a)和最小径(b)。肿瘤体积(cm3)=ab2/210将肿瘤体积变化对时间作出生长曲线,可由曲线的斜率变化判断药物抑制肿瘤生长的作用,尤其应观察肿瘤能否完全消退。11[注意事项]1.在同一品系内,发病率比较稳定,而不同品系间差别甚大。2.动物乳腺癌发生与遗传基因、乳癌因子(即致乳癌病毒)及激素有关。3.饲料的变更有明显影响,要用固定全价营养饲料。4.配对分组。12二、AKR白血病模型AKR小鼠为白血病高发品系，淋巴细胞白血病发病率雄性76%~90%，雌性为68%~90%。[操作步骤]实验用6~12月龄AKR小鼠,此时鼠的脾和淋巴结肿大,血象异常。经血液检查确诊为白血病后的次日,配对分组并开始给予受试药,观察结果。13观察指标：末梢血象,白细胞数,淋巴结和脾大小,动物生存时间。有效者生存期比对照组延长,并根据血象评价药物的诱导缓解和维持缓解作用。各鼠白血病的病程不一,自发瘤确诊后,实验时应配对分组。[结果判定][注意事项]14[自发性肿瘤的总体评价]动物自发性肿瘤的病因往往是由动物的遗传特性决定的,与人癌的病因有较大距离。各动物肿瘤生长速度差异较大,很难在限定时间内获得大量生长均匀的荷瘤动物(tumor-bearinganimals)因此，自发性肿瘤动物模型很少在抗肿瘤药物的常规筛选中广泛应用。15第二节诱发性肿瘤动物模型(animalmodelsofinducedtumor)概念:在实验条件下;使用致癌物(carcinogens);诱发动物发生肿瘤16[基本原理]利用外源性致癌物引起细胞遗传特性改变，从而出现异常生长和高增殖活性细胞,形成肿瘤。外源性致癌物主要有化学性、物理性(如放射性物质)及生物性(如诱发动物肿瘤的病毒),其中以化学性致癌物最为常用。17一、诱发性肿瘤动物模型的基本方法实验时,必需注意选择合适的致癌方法、动物种系、致癌物及其溶剂、给予剂量、途径以及观察时间等。致癌物的剂量应能保证动物的存活率较高、诱发期较短和诱发肿瘤频率较高。18常用的致癌物给予方法和途径1.涂抹法:涂抹在背部及耳部皮肤,主要用于诱发皮肤肿瘤。2.经口给药法：通过饮水、饲料或灌喂动物。常用于食道癌、胃癌及大肠癌等。3.注射法：致癌物制成溶液,经皮下、肌内、静脉或体腔等途径注入体内,本法较常用。19常用的致癌物给予方法和途径4.气管注入法：常用于诱发肺癌。5.穿线法：将致癌物置于无菌试管内,加热使之液化,吸附于预制的线结上,再将此线结穿入靶组织而诱发肿瘤。6.埋藏法：包埋于皮下或其他组织内。20二、诱发性肿瘤模型的动物和致癌物动物：大鼠，小鼠，犬等致癌物：多环碳氢类亚硝胺类偶氮类黄曲霉毒素（饲料中含0.001~0.015ppm黄曲霉毒素B1,喂养6个月,诱发大鼠肝癌）。ppm=partspermillion2122[诱发性肿瘤模型的总体评价]约80%人癌是由环境因素引起的,诱发性肿瘤的病因与人癌的情况近似,且均经过较长演变过程而成瘤。动物诱发性肿瘤是比较类似于人类肿瘤的动物模型。然而,人癌的发生原因十分复杂,往往并非由已知的动物致癌物所引起。另外,动物诱发性肿瘤的组织病理类型、发生发展过程也不一定与人癌完全一致。23本模型的最大困难是诱癌时间长、成癌率常达不到100%,而且动物之间肿瘤发生时间、发展速度的个体差异很大,难以将未治疗的动物作为治疗动物的对照。24第三节移植性肿瘤动物模型(Animalmodeloftransplantingtumors)25移植性肿瘤动物模型是指将动物或人体肿瘤移植到同种或异种动物体内连续传代而形成的肿瘤。该实验法是抗肿瘤药物筛选最常用的体内方法，具有重要作用。目前临床上常用的抗肿瘤药大多是首先经该实验法而被发现的。26一般给予试验药7~10d,在第8~11d可解剖动物获得结果。通过一些指标的观察,可以判断试验药是否有具有抑制肿瘤生长的作用。这是任何体外试验所不能替代的,其结果可为抗癌药物疗效提供重要依据。27它比前述的自发性和诱发性动物肿瘤更易实施。现有移植性肿瘤接种成功率可达100%,可在同一时间内获得大量(数十至百余只动物)、生长相当均匀的肿瘤。28移植性肿瘤常用的动物为小鼠、大鼠和地鼠。研究药物的抗肿瘤作用可选择三种或三种以上小鼠、大鼠的移植性肿瘤进行实验治疗；抗肿瘤药物筛选时，每批动物的来源应一致；一、动物的选择29根据瘤株的特点选用近交系、远交系或F1动物；雌雄性动物均可应用(乳腺癌等必须用雌性动物)。▲每批实验只用同一性别动物。▲小鼠体重18~22g，大鼠体重50~70g▲每组至少10只动物，裸鼠可用5~10只。30二、肿瘤细胞的选择复制移植性肿瘤模型需要使用肿瘤细胞株(瘤株，tumorstrain)或细胞系(cellline)。细胞株(cellstrain)是指通过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群。31瘤株的组织学类型和生长特征趋于稳定，并能在同系、同种或异种动物体内移植并连续传代。生长特征，包括接种成活率、生长速度、自动消退率、宿主寿命与宿主反应等。细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。32目前，动物移植性实验肿瘤（包括实体瘤、腹水瘤和白血病）约500种，还有大量人的瘤株或细胞系。常用的动物移植性肿瘤瘤株或细胞系有：33肉瘤S180腹水型或实体型艾氏腹水癌或实体型肝癌腹水型（HepA）或实体型（H22）小鼠白血病L1210、P388及L615小鼠黑色素瘤（B16）小鼠Lewis肺癌肉瘤S37结肠癌C38、结肠癌C26子宫颈癌（U14）大鼠Walker癌肉瘤256（W256）34筛选抗癌药物时，最好选用3类瘤株，即肉瘤、腹水型肿瘤和白血病株。在众多移植性肿瘤中，目前最受重视和应用最广的是：小鼠Lewis肺癌小鼠黑色素瘤B16小鼠白血病P388瘤株或细胞系的选择应尽量考虑与临床拟研究肿瘤的性质、部位等相近，如拟研究肝癌的治疗，可首选肝癌瘤株。35一种药物不一定对各种类型移植性肿瘤都有效，如果仅选一种瘤株进行药物筛选就可能出现漏筛。还必须指出，动物肿瘤的生物学特点与人类肿瘤有较大差别，对动物肿瘤生长有抑制作用的药物对人类肿瘤未必有效。36三、接种方法(一)一般要求整个操作应在无菌条件下进行，可在无菌室和超净工作台内操作。动物处死后消毒皮肤，对每个实体瘤应分别使用灭菌的外科器械切取，对腹水瘤则应分别用灭菌的注射器抽吸。37接种方法瘤块污染常是接种失败的主要原因，应特别注意!!在高温季节操作时，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块直接降温。常用接种部位：实体瘤_____腋窝皮下肌肉接种___大腿肌肉腹水型肿瘤__腹腔38(二)接种操作1.实体瘤(1)基本过程（以实体瘤为例）冻存的瘤株---移入宿主体内（瘤源动物）-------7-10d(增殖)获得瘤块---制备瘤块---给动物接种(受体动物)39(2)瘤块接种法：选取接种后7~10d生长状态良好的瘤源动物，颈椎脱臼处死，消毒操作部位皮肤。切开皮肤，剥离出瘤块，置于平皿上,平皿应放置在冰块上,内置少许灭菌的PBS或其他营养液,剔除非肿瘤组织和坏死组织，选取生长良好而无变性坏死、淡红色、鱼肉状的瘤组织，在无菌平皿内剪成2mm3的小块。黑色素瘤则呈黑色或黑紫色注意不用瘤中央的坏死部分40瘤源动物---颈椎脱臼处死------消毒切开皮肤---取瘤剪成2mm3小块---用套管针抽吸瘤块接种于受体动物右前肢腋窝皮下缩短接种操作时间,从瘤块取材到接种完毕一般应在30min内；平皿内放置少许灭菌PBS或其他营养液；接种部位皮肤应先消毒。流程图：41(3)瘤细胞悬液接种法如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞悬液接种:取几个瘤块---除去坏死部分---混合瘤块---剪成小块---匀浆器单向研匀---放入无菌容器---生理盐水稀释成1:3~1:4悬液每只动物接种0.2ml；整个操作应在30min内完成；每次抽吸前应将细胞混匀。42(4)培养细胞接种法：对数生长细胞→胰酶消化→PBS洗涤2次→计数活细胞数→用生理盐水稀释成细胞悬液→细胞悬液置于冰上→注射到接种部位(0.2ml,含1×106~1×107个细胞)。432.腹水型肿瘤(1)抽取腹水：选择接种后7~10d的健康动物颈椎脱臼处死---腹部皮肤消毒---剪开剥去腹部皮肤---抽吸腹水---放入无菌容器内---若用几只动物作为瘤源动物时,应将腹水混合.4445另取小量腹水,置于加有肝素的干试管内,作为观察细胞形态及细胞计数用。将空针中剩余的腹水制备推片,瑞氏染色,镜下进行细胞分类计数,其中瘤细胞数应≥95%。抽出的腹水应为乳白色浓稠液体,若为黄色或含有大量红细胞时应弃去。46(2)细胞计数：取肝素管内的瘤细胞,用生理盐水稀释10倍;取稀释液0.9ml,加0.2%台盼蓝生理盐水溶液0.1ml混匀。用血细胞计数法计数瘤细胞总数和死细胞数。瘤细胞死亡后，细胞膜通透性发生改变，细胞可被台盼蓝染成蓝色,而活细胞不着色。4748计数计数板四角大方格内的细胞数,计数时对压边线的细胞,计左不计右,计上不计下。计数四个大方格内的细胞总数,然后按下列公式计算总细胞数和活细胞总数。四大方格细胞总数－死细胞数活细胞数/ml悬液＝×稀释倍数×10000449(3)接种：腹水用含葡萄糖的无菌Hanks液稀释至适当的浓度,每只鼠腹腔注入0.1~0.2ml。整个操作应在60min内完成。503.白血病株的接种腹水型白血病如L1210及P388的接种方法同腹水型肿瘤接种法。51四、肿瘤细胞的冻存与复苏为了使肿瘤细胞能得以长期使用，防止退化或变异，保存不同代细胞的特征，对肿瘤细胞或瘤株进行冷冻保存是很必要的。一般在液氮中冻存1~2年，细胞存活率可达80%~90%。521.冻存方法取对数生长期增殖细胞，在冻存前一天最好换一次培养液。经胰蛋白酶消化、离心、洗涤，用含7份培养液、2份小牛血清、1份DMSO配成(1~5)×106个/ml的细胞悬液，转入细胞冻存管，贴上标签，注明细胞来源、名称及冻存日期。53一般将冻存管:①4℃--30min；－20℃--4h；－70℃--过夜--然后入液氮。②可将冻存管悬挂液氮罐口处过夜，之后浸入液氮中。③可用2cm厚脱脂棉将冻存管严密包裹,－20℃~－30℃过夜，然后除去脱脂棉直接放入液氮中。542.冻存细胞的复苏方法从液氮罐中取出冻存管，迅速放入38℃~40℃水浴中，并不停摇动使其在1min内全部融化，500~800r/min离心5min，弃上清，加入培养液，转入培养瓶内培养。次日更换培养液，以后按常规培养。55细胞冻存及复苏的