卫生化学――紫外可见分光光度法

12紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-Vis）是光谱分析法中一种重要的、广泛应用的分析方法。光谱分析法（spectroscopicanalysis）：是指利用物质与辐射能作用时所吸收或发射辐射的特征和强度而建立起来的定性、定量及结构分析方法。3如原子吸收分光光度法如原子发射光谱法如紫外-可见、红外如分子荧光分析法4紫外－可见分光光度法是根据物质分子对紫外或可见光区电磁辐射的吸收特征和吸收程度建立起来的分析方法．紫外区波长200～400nm可见区波长400～760nm特点灵敏度、准确度高、操作简便快速、应用广泛5待测物质6第一节概述一、电磁辐射和电磁波谱光属于电磁辐射，基本单位是光子，光子具有波粒二象性：波动性7光的传播速度：c－真空中光速2.99792458×108m/sn－折射率，真空中为1λ－波长，单位：m,cm,mm,µm,nm,Å（1Å=10-10m）γ－频率，单位：赫兹(周)Hz次/秒ncV8光量子，具有能量：h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·sγ－频率E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.602×10-19J微粒性hE9结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低。单色光：具有相同能量(相同波长)的光。混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起.例如白光。波粒二象性hchE高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级跃迁χ射线来自内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波波长长电磁辐射按波长顺序排列称为电磁波谱。1112第二节基本原理1.紫外-可见吸收光谱的形成当光通过气态、液态或固态的物质时，物质分子选择性吸收辐射，产生紫外-可见吸收光谱，又称为分子吸收光谱。13物质分子内部三种运动状态对应三种能级：电子绕核运动（电子跃迁）→电子能级△E电原子在平衡位置上振动→振动能级△E振分子绕轴转动（分子转动）→转动能级△E转转振电EEE远红外吸收光谱红外吸收光谱可见吸收光谱紫外转振电mevEmevEmevE25~25005.0~005.025.1~251~05.025.1~06.020~114电子基态电子激发态J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J115物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，物质也只能选择性地吸收那些能量相当于该分子振动能变化△Ev、转动能变化△Er以及电子运动能量变化△Ee的总和△E的辐射。由于各种物质分子内部结构的不同，分子的各种能级之间的间隔也互不相同，这样就决定了物质对不同波长光线的选择性吸收。有色物质的不同颜色是由于吸收了不同波长的光（互补光）所致。172.分子吸收光谱及其特征将不同波长的单色光依次通过一定的溶液，分别测出对各种波长的光的吸收程度（用A表示）。以波长为横坐标，吸光程度为纵坐标作图，所得的曲线称为吸收曲线（absorptioncurve）或吸收光谱(absorptionspectrum)。18吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λmax吸收谷→λmin肩峰→λsh末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生A1920（一）有机化合物的电子跃迁类型PxPyPzPxPyPzππ*σ*σn二、紫外－可见吸收光谱与分子结构的关系21按能量大小：σ→σ*n→σ*π→π*n→π*221.σ→σ*跃迁．饱和烃类（单键，且都是σ键）吸收光能后多发生此类跃迁，此跃迁所需能量大，（大约350kj/molσ键）一般吸收＜150nm的光，属于远紫外区（真空紫外区）23２．n→σ*跃迁含有杂原子（O、N、S、X）的饱和烃衍生物，这些杂原子上的n电子向着σ*跃迁。吸收波长在200nm左右．24３．π→π*此跃迁所需能量小（约200kj/mol键）．吸收波长为200nm左右．具有碳—碳双键（三键）的化合物会发生此类跃迁．孤立的π→π*跃迁．吸收波长在160～190nm左右.如CH2=CH2λmax=165nmε=104共轭双键的π→π*跃迁．由于π与π键之间相互作用形成离域键，使π→π*跃迁所需能量减小，而且共轭键越长所需能量越小．如丁二烯CH2=CH-CH=CH2λmax=217nm,ε=2100025４．n→π*易发生在含有杂原子的不饱和基团中，如C=O、C=S、—N=N—等化合物。这些杂原子都有未成键的孤电子对．此类跃迁一般在近紫外区（200-400nm），但ε小，在10～100之间．261．电荷迁移跃迁（亦称内ox—red过程）所谓迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向接受体相联系的轨道上跃迁，过程见下：NCH3CH3NCH3CH3－+hvhvCROCRO+_吸收谱带较宽、吸收强度大、εmax≥104，是强吸收带。电子接受体电子接受体电子给予体电子给予体CNSFeCNSFehv23电子接受体电子给予体（二）无机化合物的电子跃迁类型272．配位场跃迁四、五周期中的过渡金属元素分别有3d和4d轨道，镧系锕系分别含有4f和5f轨道，在配体存在下过渡元素五个能量相等的d轨道和镧、锕元素七个能量相等的f轨道分别分裂成几组能量不等的d轨道及f轨道.当它们吸收光能后，低能态的d电子或f电子可以分别跃迁到高能态的d轨道及f轨道上去。一定要有配体的配位场作用.281．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具n电子和π电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁跃迁E较低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强2．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）32三、光的吸收定律（一）Lambert-Beer定律一束单色光通过含吸光物质的溶液时Ia入射光I0透过光ItI0＝Ia+It+Ir≈Ia+It由上式可知,I0不变，若Ia↑则It↓,反之亦然33我们把：It／I0=T称作透光率（度）T×100=T%称作百分透光率（度）T越大，表示溶液对光的吸收越少T越小，表示溶液对光的吸收越多常用吸光度来表示物质对光的吸收程度：tIITA0lg1lg34朗伯定律(1760年):A=lg(I0/It)=k1b当入射光的λ,吸光物质的c一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比。比尔定律(1852年):A=lg(I0/It)=k2c当入射光的λ,液层厚度b一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比。35朗伯-比尔定律式中：A：吸光度；T:透射率；b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c：溶液的浓度，单位mol·L-1或g·L-1；K：吸光系数意义:当一束平行单色光通过均匀、非散射的溶液时，其吸光度与溶液中吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.KbcTIIAt1lglg036值得注意的是：透过率T与c或b之间的关系是指数函数关系．吸光度A与c或b之间是简单的正比例关系．1.00.50ACC100500T%T＝10–A=10-KbcA＝-lgT＝-lg(It/I0)=Kbc37应明确定律的三个应用条件：1）稀溶液（C＜0.01mol/L)2）入射光为单色光3）均匀介质，可以为固体、液体和气体吸光度特性——加和性：A总=A1+A2+A3+A4…..38吸光系数（Absorptivity）cbAabcAbcEA1%1cmc---mol/Lε---摩尔吸光系数L·mol–1·cm-1c--g/La---吸光系数L·g–1·cm-1c--g/100mLE1%1cm---比吸光系数100mL·g–1·cm-1表示方法相互换算：MaE10101%1cm39摩尔吸光系数ε物理意义：当一定波长的单色光通过浓度为1mol/L，吸收池厚度为1cm的溶液时测得的吸光度。入射波长不同，ε不同溶剂不同，ε不同物质性质不同，ε不同氯仿465ε可作为定性依据在最大吸收波长λmax处，常以εmax表示。41（二）偏离Beer定律的因素偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面:1）光学因素2）与试样溶液有关的因素1.00.50AC正偏离负偏离421.光学因素1）非单色光的影响：非单色光指的是包含一定波长范围的有限宽度的谱带，是以λ０（中心吸收波长）为中心的一狭窄波长范围的复合光，对于带宽为△λ（即图中的Ｓ＝λ２－λ１）的单色光，测得的吸光度一般小于λ０处的真实吸光度值，从而产生负偏离。432）杂散光的影响：杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。◆若样品不吸收IS则（I0+Is）／（I+Is）＜I0／I，使A↓◆若样品吸收IS，则反之，Ａ↑。StSIIIIA0lg442.溶液的物理及化学因素的影响１）溶液浓度的影响Beer定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(C10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度C10-2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。45２）体系（介质）不均匀的影响根据定律的应用条件之三（即均匀介质），一般真溶液质点小，对光的散射不特别厉害，但混浊液散射比较突出。胶体、乳胶、悬浮物、沉淀等非均相体系产生的光散射会引起对朗伯-比耳定律的偏离。解决的办法：用空白做对比。46第三节紫外-可见分光光度计一、分光光度计的主要部件碘钨灯氘灯单色器参比池样品池光电倍增管数据处理和仪器控制光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制47白炽光源：如钨丝灯、碘钨灯(可见光区，320～2500nm)气体放电光源：如氢弧灯（氢灯）、重氢灯（氘灯）(紫外区，180～375nm)、氙灯（紫外、可见光区均可用作光源）1.光源（辐射源）4849２．单色器作用：将光源辐射的复合光按波的长短顺序色散为单色光包括狭缝、准直镜、色散元件1)狭缝入口狭缝：限制杂散光的进入出口狭缝：让色散后所需波长的光通过。2）准直镜（透镜或反射镜）把来自入口狭缝的发散光变成平行光把来自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝。503）色散元件常用的色散元件有三角棱镜和光栅棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同51光栅在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600，1200，2400条/mm)，利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。优点：波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便523．吸收池又名:比色皿，用于盛待测及参比溶液玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）534．检测器作用：是检测通过溶液后的透过光强度（光信号，并把光信号转变成电信号）１）光电管锑铯作阴极：紫敏（200～625nm)银／氧化银：红敏（625～1000nm)90VDC直流放大阴极R-+光束e阳极丝（Ni）抽真空54２）光电倍增管（photomultipliertube,PMT）石英套光束栅极，Grill阳极屏蔽光电倍增管的放大倍数，主要取决于电极间的电压。55二、分光光度计的类型56１．单波长单光束分光光度计57特点：结构简