中药中黄酮类化学成分的提取分离技术黄酮

中药化学实用技术学习情景二——中药中黄酮(Flavonoid)类化学成分的提取分离技术学习情境二中药中黄酮类化学成份的提取分离技术2掌握黄芩、葛根中黄酮的提取分离原理及操作技术；熟悉银杏叶和槐花中黄酮的提取分离原理及操作技术；了解补骨脂和山楂中黄酮的提取分离原理及操作技术。知识要求3能力要求学习目标1掌握中药中黄酮类化学成分的提取分离原理及操作技术。熟练进行黄芩、葛根、银杏叶中黄酮的提取分离操作；能进行补骨脂、槐花中黄酮的提取分离操作。教学内容学习提示黄酮类化学成分的结构、性质及提取分离知识任务一实训黄芩中黄酮化合物的提取分离技术黄芩中黄酮化合物的提取分离及检识学习提示黄酮的结构与分类一二三黄酮的理化性质及检识黄酮类化学成分的提取分离分布生物活性经典定义广泛存在于自然界的一大类天然有机化合物。由于多呈黄色，4位也多有酮基黄酮是广泛存在于自然界的一类化合物，它们在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离状态存在。黄酮类化合物的生理活性强而广，有的可降低血脂，有的具有很强的保肝作用，有的还具有抗炎和扩冠作用。黄酮现在认为：黄酮类化合物是由两个苯环（A环与B环）通过三碳链相互连接成的具有6C-3C-6C基本骨架的一系列化合物黄酮的结构与分类过去认为：黄酮基本母核为2-苯基色原酮OO123456781'2'3'4'5'6'O123456781'2'3'4'5'6'ACB主要的天然黄酮类化合物分为以下几类（见下页）类型基本结构类型基本结构黄酮二氢查耳酮黄酮醇花色素二氢黄酮黄烷-3-醇二氢黄酮醇黄烷-3，4-二醇异黄酮双苯吡酮(酮)二氢异黄酮噢哢(橙酮)查耳酮芹菜素(5，7，4三羟基黄酮)木犀草素(5，7，3ˊ4ˊ-四羟基黄酮)OHHOOHOOOHOHHOOHOOOHOHHOOHOOOHOOOHHOOHOHOHOHOHOOCH3HOCH3OOOHOOCH3OH芸香糖OOROOHOHHOOOglc杨梅素(3，5，7，3ˊ4ˊ5ˊ-六羟基黄酮)橙皮苷葛根素(C-苷)山山柰酚((3，5，7，4ˊ-四羟基黄酮)杜鹃素R=H大豆素=glc大豆苷芸香糖常见黄酮类化合物结构式黄酮苷碱性物理性状溶解性还原反应酸碱性显色反应游离黄酮金属盐类试剂的络合反应硼酸显色反应酸性二黄酮类化合物的理化性质及检识1.物理性状多为结晶性固体，少数（如黄酮苷类）为无定形粉末多呈黄色，且颜色与分子中的交叉共轭体系(发色团)及助色团有关黄酮苷均有旋光性，且多为左旋。游离的二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢异黄酮和黄烷醇等具有旋光性。其余的游离黄酮则无旋光性在紫外灯光下普遍具有荧光交叉共轭体系的存在:能形成交叉共轭体系的黄酮类化合物，常有明显的黄色，并且共轭程度大小、共轭链的长短决定了颜色的深浅。黄酮本身其色原酮部分并无颜色，但当2位引入苯基后，即形成交叉共轭体系，且能通过电子的转移和重排使共轭链连续地延长，而呈现出颜色。助色团对颜色的影响：助色团（-OH、-OCH3等）能使颜色加深，但主要指助色团处于7或4′位时，由于能形成p-π共轭，可促使电子的转移和重排而形成交叉共轭体系，从而使颜色明显加深，但-OH、-OCH3引入其他位置时，对颜色的影响较小。OOOOOO4'7++有颜色交叉共轭体系无颜色2.溶解性游离黄酮一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。花色苷元（花青素）类以离子形式存在，水溶度较大。黄酮类甙元分子中羟基数越多，水中的溶解度越大。黄酮苷游离黄酮的羟基被糖苷化后，水溶性增加，脂溶性降低，一般易溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶及稀碱溶液中，而难溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂中。★游离黄酮水甲醇乙醇乙酸乙酯氯仿乙醚稀碱水-+++++++（酚羟基)溶解性取决于分子的立体结构取代基团的性质、数目、连接位置引入羟基，数目多，7、4‘-位，水溶度较大羟基甲基化（-OCH3）,水溶度降低R=H平面型分子非平面型分子黄酮二氢类（C-环半椅式结构）黄酮醇异黄酮（羰基与B-环立体障碍）查耳酮分子间排列不紧密，（交叉共轭）水分子易于进入水溶度小水溶度大2OOHRHR=H二氢黄酮R=OH二氢黄酮醇水甲醇乙醇乙酸乙酯氯仿乙醚稀碱++++---+黄酮类化合物溶解性（极性）规律:三糖苷双糖苷单糖苷苷元3-O-糖苷7-O-糖苷（平面性分子）花色素(平面性分子,离子型)非平面性分子平面性分子★黄酮苷(亲水性)3.酸碱性7，4′-2OH＞7-或4′-OH＞一般酚羟基5-OH7，4′-2OH者，由于ρ-π共轭效应，使酸性增强而溶于碳酸氢钠水溶液。7-或4′-OH者，只溶于碳酸钠水溶液，不溶于碳酸氢钠水溶液。具有一般酚羟基者只溶于氢氧化钠水溶液。仅有5-OH者，因可与C4=O形成分子内氢键，故酸性最弱。因此，可用pH梯度萃取法来分离黄酮类化合物。酸性:黄酮类化合物因分子中具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶和甲酰胺等中。其酸性强弱与酚羟基数目的多少和位置有关。3.酸碱性碱性:因母核中γ-吡喃酮环上的1位氧原子有未共用电子对，故表现出微弱的碱性。可溶于浓硫酸、浓盐酸等强无机酸生成盐，该盐极不稳定，加水后即分解。还原反应4.显色反应反应类型鉴别特征鉴别意义备注盐酸-镁粉黄酮、二氢黄酮、红~紫红黄酮类特征性假阳性反应黄酮醇、二氢黄酮醇红~紫红鉴别反应（花色素）（最常用）查耳酮、橙酮（-）儿茶素类、异黄酮（-）四氢硼钠二氢黄酮、二氢黄酮醇红~紫红二氢黄酮类特有还原反应其它黄酮类（-）钠汞齐反应黄酮、二氢黄酮红异黄酮、二氢异黄酮红黄酮醇类黄~淡红色二氢黄酮醇类棕黄色金属盐类试剂的络合反应反应类型鉴别特征及鉴别意义备注锆盐枸橼酸锆盐-枸橼酸3-OH或5-二OH黄色黄色不褪PPC黄色褪去氨性氯化锶(SrCl2)邻二酚羟基绿、棕乃至黑色三氯化铁(FeCl3)酚羟基紫、蓝、绿三氯化铝3-OH，4-C=O黄色（AlCl3）5-OH，4-C=O鲜黄色荧光PPC\TLC邻二酚羟基（4‘或7，4’黄酮醇，天蓝色荧光）硼酸显色反应硼酸5-羟基，4-羰基黄酮黄色，绿色荧光（草酸液）（H3BO3）6′-羟基，4-羰基查耳酮黄色，无荧光（枸橼酸）三黄酮的提取与分离黄酮的提取与分离提取分离pH梯度萃取法溶剂萃取法柱色谱法HPLC色谱法溶剂提取法检识理化检识色谱检识（一）提取方法—溶剂法溶剂法关键溶剂的选择选择依据黄酮类成分的存在状态（游离、苷）及溶解性溶剂的溶解性能提取方法（煎煮法、渗漉法、回流法等）的选择溶剂提取原理游离黄酮黄酮苷备注乙醇溶解范围广++（甲醇）苷、苷元均可溶（90~95%）(60%）甲醇毒性大沸水多糖苷易于水+成本低、安全,水溶性杂质多碱性水或稀氢氧化钠溶出能力强碱性乙醇酚羟基的酸性++石灰水除杂质效果好HPLC色谱（二）分离分离依据：成分(黄酮与杂质、苷与苷元、苷元与苷元)之间的极性（分配系数K）差异。分离依据：游离黄酮类化合物的酸性差异。pH梯度萃取法溶剂萃取法柱色谱法常用聚酰胺和硅胶色谱。（1）聚酰胺柱色谱（首选法）洗脱顺序（含水溶剂：乙醇-水等）①苷元相同：叁糖苷→双糖苷→单糖苷→苷元（酚羟基比例）②母核上羟基越多，洗脱越慢（酚羟基数量）③酚羟基数量相同：邻羟基的→对（间）羟基的（酚羟基的位置）④芳香核、共轭双键越多，洗脱越慢（酚羟基所处母核的共轭程度）⑤不同苷元：异黄酮→二氢黄酮醇→黄酮→黄酮醇母核共轭程度较后两者小，后者比前者多一个羟基。（2）硅胶柱色谱洗脱顺序：羟基越多，极性越大，越后洗出（不分醇羟基、酚羟基）适用于各种黄酮类化合物的分离。原理：反相柱色谱（黄酮类化合物极性大）固定相：ODS流动相：水-乙晴不同比例。任务一黄芩中黄酮类化合物的提取分离技术学习目标一二三任务导入必备知识五四六相关知识链接及拓展课堂互动目标测试一学习目标2掌握黄芩中黄酮类化合物的提取、分离及鉴定技术。熟悉黄芩中黄酮类化合物的结构及性质。了解黄芩中黄酮类化合物的存在及生物活性。知识要求3能力要求1掌握黄芩中黄酮类化学成分的提取分离原理及操作技术。熟练进行黄芩中黄酮类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会黄芩中黄酮类化合物的色谱鉴定技术。学习目的任务导入：黄芩为唇形科植物黄芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）的干燥根。从其中分离出的黄酮类化合物有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、木蝴蝶素Ａ等20多种。其中黄芩苷（4.0%～5.2%）是主要有效成分，有抗菌消炎、降低转氨酶等作用。黄芩苷元的磷酸酯钠盐可用于治疗过敏、哮喘等疾病。黄芩中黄芩苷的提取工艺流程：黄芩苷分子中有羧基，酸性较强，在植物体内多与镁离子成盐，且黄芩苷的镁盐水溶性较大，故可用水为溶剂提取。水提取液酸化后，该镁盐又转化为有游离羧基的黄芩苷，因其难溶于酸水而沉淀析出。黄芩苷的提取分离流程如下：加适量水搅匀，加40%NaOH调至pH7，再加入等量乙醇，过滤沉淀沉淀上清液黄芩粗粉黄芩苷水洗，50%乙醇洗涤，再用95%乙醇洗涤或重结晶加HCL调pH1～2，充分搅拌，加热至80℃，保温30分钟，过滤滤液药渣滤液分别加10倍、8倍量水煎煮2次，每次1小时，过滤药渣加HCL调pH1～2，80℃保温30分钟，静置，离心沉淀滤液（二）黄芩中黄酮类成分的提取分离（一）黄芩中黄酮类主要有效成分及结构三必备知识黄芩苷（baicalin）黄芩素（baicalein）汉黄芩苷（wogonoside）汉黄芩素（wogonin）（一）黄芩中黄酮类主要效成分及结构OOHOHOOOOHOHOHCOOHOHOHOOHOOHOOOOHOHOHCOOHOCH3OOHOHOOCH3O黄芩中黄芩苷为主要有效成分，黄芩苷为淡黄色针晶，熔点223℃，几乎不溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，可溶于热乙酸，易溶于碱性溶液。黄芩苷经水解能生成苷元黄芩素，黄芩素分子中具有邻三酚羟基，易被氧化为醌类衍生物而显绿色。这是黄芩在放置过程中或处理不当时易变绿的原因。（二）黄芩中黄酮类化合物的提取分离黄芩中黄酮类化合物的分离方法一：方法二：（二）黄芩中黄酮类化合物的提取分离甘肃黄芩根粉末乙烷、丙酮和甲醇分别加热回流提取3次，过滤减压浓缩丙酮部位甲醇部位多次硅胶柱层析，氯仿-甲醇-乙酸（100：20：0.5）梯度洗脱浓缩析晶，重结晶黄芩苷木蝴蝶素汉黄芩素黄芩素甘黄芩苷元甘黄芩素四知识链接及拓展苷检识结构与分类理化性质苷（glycosides）又称糖苷、甙或配糖体，是糖及其衍生物的端基碳原子与另一非糖物质（称为苷元或配基）连接而成的化合物。苷糖与苷元连接的化学键称为苷键，形成苷键的原子称为苷键原子。苷类在中药中分布很广泛，且具有多方面的生物活性，是一类重要的中药化学成分。氮苷按照苷键原子进行分类氧苷硫苷碳苷红景天苷（醇苷）OOOHOglcCH2OHOOOCH2CH2OHROOOOCHCN苦杏仁苷（氰苷）山慈姑苷（酯苷）天麻苷（酚苷）OSCN(CH2)2OS3HCHCHSOCH3萝卜苷NNNNNH2HOOOHOHCH2OHO巴豆苷虫草苷芦荟苷NNNNNH2O四知识链接及拓展结晶与重结晶原理溶剂选择操作技术结晶与重结晶的基本原理结晶与重结晶法是利用混合物中各成分在不同温度溶剂中溶解度的不同来达到分离的方法。结晶溶剂的选择合适的溶剂就是在冷时对所要的成分溶解度小，而热时溶解度又较大的溶剂。溶剂的沸点亦不易太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。结晶溶剂又常会用到混合溶剂。结晶的操作技术（一）结晶分离技术的一般操作过程1．将需结晶物质置于锥形瓶中，加入较需要量略少的溶剂，于水浴上加热至微沸；2．将热溶液趁热抽滤，以除去不溶的杂质；3．将滤液冷却，使结晶析出；4．滤出结晶，必要时用适宜的溶剂洗涤结晶。（二）结晶条件的控制1．趁热过滤得到的滤液应长时间静置，逐渐冷却，避免温度骤降使析晶过快带出杂质。2．若滤液久置无结晶析出，可采取的方法有：松动瓶塞；加入少量晶种；玻璃棒摩擦；加有机可溶性盐类盐析。五课堂互动1．聚酰胺柱色谱用于分离黄酮类化合物（苷、苷元）的原理、方法及洗脱规律。2．简述黄酮类化合物的酸性规律及在黄酮苷元分离中的应用。3．何谓交叉共轭体系，它与黄酮