中药制剂检验新技术

第六章中药制剂检验新技术目前，各种先进的分析技术和方法越来越多地用于中药及其制剂，从而大大提高了药品检验工作的质量和水平。例如，指纹图谱技术（FP）、毛细管电泳法（CE）、电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）、原子吸收分光光度法（AAS）以及各种色质联用技术等。其中有些已被《中国药典》收载，成为法定的检验方法。本章将重点介绍指毛细管电泳法和超临界流体色谱法。第一节毛细管电泳法（一）原理毛细管电泳（CE）亦称为高效毛细管电泳法（HPCE），是20世纪80年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法。该法系以弹性毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和分配行为的差异而实现分离，因此可将其视为经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。CE分离原理图示（二）特点高效、低耗、快速、广谱与HPLC比较1.柱效更高，理论板数可达105-106m-1，这主要是由于该法无固定相，不存在传质差异，整个流体就像塞子似的以均速向前流动。2.分析速度更快，几十秒至十几分钟内即可完成一个试样的分析。3.溶剂和样品消耗极少，样品用量仅为纳升（nl）级。不需高压泵输液，毛细管价格低廉，因此工作成本更低。4.通过改变操作模式和缓冲溶液的成分，该法有很大的选择性，可对各种成分进行有效的分离。例如，中性有机分子、无机离子、蛋白质等高分子化合物，甚至整个细胞或病毒。HPLCCE（三）分离模式（共6种）1.毛细管区带电泳（CZE）CZE又称为自由溶液区带电泳，系毛细管电泳中最基本、应用最广的一种操作模式，即将分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性分子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。但中性组分彼此不能分离，因均随电渗流（EOF）一起迁移。出峰时间称为迁移时间（tm），相当于高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）中的保留时间。CZE较适合带电溶质的分离，由于中性物质均系靠电渗流迁移，不存在迁移速度的差异，故不能实现分离。2.胶束电动毛细管色谱（MEKC或MECC）该法系以胶束为假固定相的一种电动色谱。当操作缓冲液加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）或十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、胆酸等，这时表面活性剂就聚集形成胶束（假固定相），其亲水端朝外，憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分配系数存在差别而被分离。对于常用的阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），进样后极强亲水性组分不能进入SDS胶束，随操作缓冲液流过检测器（容量因子k’=0）；极强憎水性组分则进入SDS胶束的核中不再回到水相，最后到达检测器(k’=∞)。其分离原理见下图。该法适合中性物质的分离。因不同的溶质在胶束中的分配系数不同，其迁移速度存在差异而实现分离。MECC弥补了CZE不能分离中性物质的不足，进一步拓宽了毛细管电泳的应用范围，鉴于中药多数为离子型和中性物质的混合体，因此MECC更适合于中药分析。3.毛细管凝胶电泳（CGE）该法在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶，该方法主要用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。另外还可利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进行分析，称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。4.毛细管等速电泳（CITP）该法采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移到各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。5.毛细管等电聚焦电泳（CIEF）将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后，毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等电点（PI）时变为中性，形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值的办法使溶质通过检测器。6.毛细管电色谱（CEC）该法是在毛细管电泳技术不断发展和液相色谱理论日益完善的基础上逐渐兴起的。它是将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液（有时再加辅助压力）进行分离的，包含了色谱和电泳两种机制，其中以色谱为主，但对荷电溶质兼有电泳作用。该法克服了CE选择性差和分离中性物质困难的缺点，同时提高了液相色谱的分离效率，形成其独特的高效、微量、快捷的特点，开辟了高效微柱分离技术的新途径。二、仪器设备（一）毛细管电泳仪的基本结构（见下图）1.电极槽和进样系统2.清洗系统3.毛细管4.检测器5.铂电极6.电极槽7.恒温系统8.记录和数据处理（二）主要部件及其性能1.毛细管毛细管为弹性石英毛细管。内径50μm和75μm两种使用较多，内径细的分离效果较好，但柱上检测因光程较短，检测限比内径粗的要差。毛细管长度称为总长度，根据分离度的要求，可选用20～100cm长度，进样端至检测器间的长度称为有效长度。毛细管常盘放在管架上，在一定温度下操作，以控制焦耳热，操作缓冲液的黏度和电导度，对测定的重复性很重要。2.直流高压电源一般采用0-30kV（或相近）可调节直流电源，可供应约300μA电流，具有稳压和稳流两种方式可供选择。3.电极和电极槽两个电极槽里放入操作缓冲液，分别插入毛细管的进口端与出口端以及铂电极，铂电极接至直流高压电源，正负极可切换。多种型号的仪器将样品瓶同时用做电极槽。4.冲洗进样系统每次进样之前毛细管要用不同的溶液冲洗，选用自动冲洗进样仪器较为方便。进样方法有压力进样、负压进样、虹吸进样和电动进样等。进样时通过控制压力、电压或时间来控制进样量。5.检测器紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器，质谱仪等均可作为CE的检测器。其中紫外检测器应用最广，它是将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去约2mm一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池对溶质进行检测。1.检测窗口2.毛细管3.基座4.调焦机构5.圆形狭缝6.狭缝7.球透镜photo冲洗装置样品瓶毛细管UVD电极槽电极槽6.数据处理系统与一般色谱数据处理系统基本相同。三、基本操作（一）准备工作1.按照仪器操作手册开机，预热，输入各项参数，如毛细管温度、操作电压、检测波长、冲洗程序等。2.按照各品种项下的规定配制操作缓冲液。操作缓冲液须过滤和脱气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中，依次放入进样器。操作缓冲液的种类、pH值和浓度，以及添加剂（用以增加溶质的溶解度和/或控制溶质的解离度，手性拆分等）的选定对测定结果的影响很大，应根据初试的结进行果调整、优化。四、系统适用性试验目的在于考察所配置的毛细管分析系统和设定的参数是否适用。测试项目和方法与高效液相色谱法或气相色谱法相同，相关的计算式和要求也相同。如重复性（相对标准偏差RSD）、容量因子（k’）、毛细管理论数（n）、分离度（R）、拖尾因子（T）、线性范围、最低检测限（LOD）等，最低定量限（LOQ）等，可参照测定。具体指标应符合各品种项下的规定。特别是进样精度，不同荷电溶质迁移速度的差异对分析精密度的影响。（二）毛细管的处理毛细管处理的好坏对测定结果影响很大。未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度（例如1mol/L氢氧化钠液在60℃）冲洗，使毛细管内壁生成硅羟基，再依次0.1mol/L氢氧化钠，水，操作缓冲液冲洗分数分钟。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗，但若发现分离性能改变，则开始用0.1mol/L氢氧化钠冲洗，甚至要用浓氢氧化钠液升温冲洗。凝胶毛细管，涂层毛细管，填充毛细管的冲洗则应按照所附说明操作。冲洗时将盛溶液样品瓶依次置于进样器，设定顺序和时间进行。（三）进样测试将待测样品溶液瓶置于进样器中，设定操作参数，如进样压力（电动进样电压）、进样时间、正极端或负极端进样、操作电压或电流、检测器参数等，开始分析。根据初试的电泳谱图调整仪器和操作缓冲液以获得优化结果。而后用优化条件正式分析。（四）数据处理有关CE的计算方法、公式等可参照《中国药典》高效液相色谱法的有关规定，将保留时间（tR）改为迁移时间(tm)即可。（五）结束工作分析完成后用水冲洗毛细管，注意将毛细管两端浸入水中保存，如果长久不用应将毛细管用氮吹干，最后关机。（六）注意事项由于进样方法的限制，目前毛细管电泳的精密度比用定量阀进样的高效液相色谱法差，故定量测定以采用内标法为宜。用加压或减压法进样时，样品溶液黏度会影响进样体积，应注意保持试样溶液和对照品溶液黏度一致；用电动法进样时，被测组分因电荷不同的电歧视现象和溶液离子强度会影响待测组分的迁移量，也要注意其影响。五、应用实例山茱萸及六味地黄丸中没食子酸的含量测定没食子酸为中药山茱萸的有效成分，山茱萸为六味地黄丸药味之一。没食子酸在碱水中可电离成阴离子，故本法采用毛细管区带电泳法（CZE），肉桂酸为内标物，测定二者中没食子酸的含量，以控制其质量。HOOHOHCOOHCHCHCOOH没食子酸肉桂酸（一）仪器与试剂Unimicro毛细管电泳仪；毛细管60cm（有效长度45cm）×75μm；没食子酸对照品，肉桂酸对照品，95%乙醇，硼砂（分析纯），去离子水，市售山茱萸，六味地黄丸（水蜜丸）（二）实验条件操作缓冲溶液为20mmol/L硼砂溶液，检测波长271nm，重力进样（10cm×5s），工作电压20kV，电泳温度20℃，每次运行前依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液、去离子水、操作缓冲溶液冲洗3min。（三）测试溶液的制备对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品19.5mg于25ml量瓶中，用95%乙醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液；称取肉桂酸对照品9.6mg，用95%乙醇溶解并稀释至25ml，作为内标溶液。山茱萸供试品溶液的制备将山茱萸药材剪碎，称取5g，加95%乙醇50ml，浸泡12小时，加热回流提取2小时，过滤，滤渣重复提取2次，合并提取液，减压浓缩至10ml，移至50ml量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml并加入内标溶液1ml，95%乙醇稀释定容至5ml，摇匀，即得。六味地黄丸供试品溶液的制备取六味地黄丸粉碎后，称取5g，提取方法同山茱萸药材，减压浓至10ml，以下操作同山茱萸供试品溶液的制备，即得。（四）系统适用性试验在山茱萸的测定中，没食子酸的理论板数n=179820，在六味地黄丸的测定中，没食子酸的理论板数n=167388，没食子酸与周围组分分离良好，无干扰组分存在。下图为山茱萸、六味地黄丸样品和对照品的电泳图谱。山茱萸（A）、六味地黄丸（B）和对照品（C）的电泳图谱（1.肉桂酸；2.没食子酸）（五）方法学考察线性范围精密量取没食子酸对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml于5ml量瓶中，各加入肉桂酸内标液1ml，95%乙醇定容至刻度，以没食子酸对照品峰面积与内标物峰面积的比值对其质量浓度作图，其线性回归方程为Y=0.0167X+0.1333，相关系数r=0.9993（n=7）。精密度山茱萸和六味地黄丸峰面积的RSD分别为2.9%和2.1%（n=5）准确度山茱萸和六味地黄丸加样回收率分别为97.4%~98.6%和99.3%~102.4%。（六）样品中没食子酸的含量测定取山茱萸供试品溶液和六味地黄丸供试品溶液分别测定，山茱萸中没食子酸含量为0.225%；六味地黄丸中没食子酸的含量为0.055%。第二节超临界流体色谱法超临界流体色谱(supercricalfluidchromatography,SFC)是以超临界流体作为流动相的色谱方法，是20世纪80年代以来发展迅速的一个色谱分支。所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。它既不是气体，也不是液体，但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。一、超临界流体色谱的特点与原理principleandcharacterofsupercriti