植物组织培养实验室的构建

第二章植物组织培养实验室构建（图为潍坊职业学院生物技术专业组培中心）植物组织培养是以无菌操作为基础的，它需要在一定的实验条件和特定的实验环境下完成一系列操作，以无菌条件为重要前提，模拟植物细胞生长发育需要的各种设备、设施、培养条件，是从事本领域工作的基础。一、植物组织培养实验室设计二、仪器和设备三、玻璃器皿和用具主要内容1、实验室要求环境要求：理想的植物组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的实验室最好建在交通方便的地方，便于产品的运送。实验室的建设均需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的，是基本层次的还是较高层次的；二是实验室的规模，规模主要取决于经费和实验性质。一、实验室设计实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。一个植物组织培养实验室必须满足3个基本的需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。此外，还可根据所从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室更加完善。2、标准组织培养室组成准备室洗涤室接种室培养室灭菌室组培实验室驯化室植物组织培养实验室的组成分体式-研究性质实验室，分开的若干房间将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等，功能明确，便于管理，但不适于大规模生产。通间式-规模化实验室，一般设计成大的通间，试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。便于程序化操作与管理，减少各环节间的衔接时间，提高工作效率。还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。培养室培养室培养室门厅走廊接种室灭菌室洗涤室准备室案例1：实验室平面设计准备室灭菌室洗涤室驯化室走廊观察室培养室接种室培养室案例2：实验室构成1、准备室功能：又叫化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：器皿洗涤、完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养材料的预处理等。要求：最好有20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。设备：准备室应具备工作台、天平，柜橱、水池、仪器、蒸馏水器，磁力搅拌器，冰箱等。药品柜冰箱天平磁力搅拌器恒温水浴锅2、洗涤室（区）功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、材料预处理，同时兼顾试管苗出瓶等。要求：需安装一个较大的水池，水泥制作，白瓷砖砌内外表面，池底放一张橡胶垫，以减少玻璃器皿的破损。下水道应畅通，以免妨碍工作。设备：玻璃器皿、塑料器皿、周转箱、洗涤刷、洗瓶机、洗涤剂、晾干台等。要求：20m2左右，明亮，通风。配置大型工作台1张。功能：培养基配制、分装、高压灭菌，无菌水的制备以及其它物品的高压灭菌等。设备：高压灭菌器、电炉、不锈钢锅、培养基分注器、物品橱1-3个，用以放置线绳、封口材料等。此外还应有烘箱、天平、酸度计、盆与桶等。3、培养基制作与灭菌室（区）要求：接种室要求干爽安静，清洁明亮。接种室宜小不宜大，一般10～20平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料，室内物品越少越好。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动；室外设有缓冲间。功能：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）、紫外线灭菌灯、空调等。4、无菌操作室（接种室）缓冲间功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。要求：可建在准备室外（需3-5平方米）或无菌操作室外（面积1平方米为宜），应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。设备：1-2盏紫外灯、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。5、培养室（区）功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。要求：约需10-20平方米左右。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等培养室的换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并安装日光灯照明。主要设备：培养架（控温控光控湿）、温湿度计、摇床、培养箱、光源、除湿机、换气扇、紫外光源等。6.观察室功能：观察并研究培养材料的生长分化情况及其形态发生规律；检查培养材料是否脱毒和发生变异。主要配备：生物显微镜，切片机，酶联免疫检测仪，PCR扩增仪等。要求：室内清洁、明亮、安静，设备先进。7.驯化棚室要求：能够控温调湿、控光通风。面积：据规模来定。注：室内驯化与设施下驯化均可。功能：提供组培苗炼苗的环境。①②③作业：植物组织培养基本实验室包括哪些组成?各有何功能与要求？二、仪器和设备１、烘箱陈列于洗涤室作用：干燥洗后的器皿高温干热灭菌测定培养物的干重气浴２、冰箱各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温保存，某些试验还需植物材料进行低温处理，普通冰箱即可。陈列于中4、加热器用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。5、其它纯水器、分装设备6、超净工作台其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适优点，通过过滤的空气连续不断吹出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。陈列于中类型：垂直式和水平式作用：无菌操作用7、酸度计用于测定培养基及其它溶液的pH，一般要求可测定pH范围1-14之间，精度0.01即可。陈列于中PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计8、显微镜陈列于观察室中类型：倒置显微镜原生质体观察普通显微镜染色体和叶片气孔观察荧光显微镜细胞活力观察解剖显微镜立体观察9、天平植物组织培养实验室需要不同精度的天平。感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（电子天平）用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。陈列于中10、高压灭菌锅用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。11、干热消毒柜用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200℃左右的普通或远红外消毒柜。13、紫外灯方便经济的控制无菌环境的装置，缓冲间、接种室和培养室必备。12、过滤灭菌器用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。14、培养架目前植物植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。成本低、设计灵活、充分利用培养空间。一般有4-5层，层间间隔30-40cm，长1.0～1.3米，宽0.6米，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架上配备2-4盏日光灯。15、培养箱细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养。16、摇床进行液体培养时，为改善通气状况，可用振荡培养箱或摇床。17、生物反应器进行植物细胞生产次生产物的实验室，还需生物反应器。其他设备可安装时间程序控制器、温度控制系统或空调；实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备；电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪、酶联免疫测定系统。1、培养容器包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。一般分为：玻璃容器—一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。1.耐腐蚀；耐高温、高压；2.透明度好；3.便于接种。塑料容器—材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器。三、玻璃器皿和用具•三角瓶：50、100、250、500ml或用250ml罐头瓶代替。•培养皿：6、9、12cm•试管：18×180mm或20×200mm•量筒：10、50、100、500、1000ml烧杯：50、100、200、500、1000ml容量瓶：100、200、500、1000ml试剂瓶（棕色）：50、100、250、500、1000ml移液管：0.2、0.5、1.0、2、5、10ml玻璃器皿的规格：刻度移液管在配制培养基时，生长调节物质和微量元素等溶液，用量很少，只有用相应刻度的移液管才能准确量取。同时，不同种类的生长调节物质，不能混淆，这就要求专管专用。常用的移液管容量有0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml、5ml、10ml等。1）镊子类：接种、转移材料或分离茎尖用，以100ml三角瓶为培养瓶，可用20cm长。2、金属用具2）剪刀类：医用剪刀，剪切割外植体或继代培养时分离材料。3）解剖刀：切割芽、茎段、愈伤组织等，继代时分离材料，也可用于微小外植体的接种等。4）解剖针：转移细胞或愈伤组织，微茎尖分离及接种等。5）其它：周转筐搪瓷盘移液管架、玻璃棒、酒精灯、试管架等。3、塑料用具各种封口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。思考题1、植物组织培养实验室包括哪些部分？2、植物组织培养实验室的常规设备有哪些？3、简述无菌操作设备的类型及作用？一、内容1．新器皿洗涤新玻璃器皿，无论是软玻璃或硬玻璃，都有游离的碱性物质，会影响组培试验结果，使用前必须洗涤。2．使用过的一般器皿如试管、烧杯、三角瓶等的洗涤。洗好后的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。3．使用过的量器如移液管、容量瓶、滴管及载玻片、盖玻片等的洗涤二、材料准备各种培养瓶、移液管、洗衣粉、洗液、周转箱、瓶刷、洗涤池、蒸馏水等。实践二洗涤技术三、方法与措施1.新玻璃器皿先用1%的Hcl溶液浸泡一昼夜，然后再按一般使用过的玻璃器皿进行洗涤。2.使用过的培养器皿洗涤方法是先将器皿中的残渣废液除去，用清水冲洗净。再用浓洗衣粉水浸泡15～30min，然后用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗，瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处，最后用流水冲洗3～4次，以彻底冲去洗衣粉残留物。3.用过的移液管、载玻片、盖玻片先放到铬酸洗液中浸泡2h以上，取出后经流水冲洗0.5h左右，再用蒸馏水冲洗一次，放入干燥箱内烘干或晾干。四、作业实验报告一份