李氏杆菌

L/O/G/O李氏杆菌内蒙古农业大学预防兽医（Listeria）二、李氏杆菌的逃脱机理三、李氏杆菌在细胞与细胞间传播四、李氏杆菌病的流行情况主要内容一、李氏杆菌属的简介五、李氏杆菌病的临床表现六、李氏杆菌病的预防和防治一、李氏杆菌简介概况李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。一、李斯特菌简介生物学特性Ⅰ1、形态与染色1.G+,两端钝圆的短链杆菌，多单在、呈V字排列、或成丛排列;2.无芽孢、无荚膜，是一种兼性胞内寄生菌；3.20～25℃：4根周身鞭毛，具有运动性；37℃：至少1根鞭毛，无运动力；李氏杆菌属Listeria李氏杆菌Listeria2、培养特性1.需氧或兼性厌氧，营养不高；对食盐耐受力很强；2.血液葡萄糖琼脂：圆形、光滑、透明、露滴状菌落，狭窄β溶血（菌落下溶血）3.麦康凯上不生长；4.4℃可生长—故称“冰箱菌”，增植约需7d；3、生化反应结果菌种项目溶血过氧化氢酶尿素酶Vp红试验甲基红试验动力试验甘露醇鼠李糖木糖葡萄糖七叶苷单增李氏杆菌＋＋－＋＋＋－+－++伊氏李氏杆菌++－+++－－+＋＋无害李氏杆菌－＋－＋＋－－√－＋＋韦氏李氏杆菌－＋－＋＋＋－√＋＋＋+为阳性；-为阴性；√为有反应ⅡLM逃脱机理二、LM逃逸吞噬体机制一般情况下，当LM细菌被内吞后，被包裹在宿主的吞噬小泡中,吞噬泡很快与溶酶体结合，使吞噬泡迅速被酸化从而降解菌体，但LM会通过李斯特菌溶血素(LLO)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶的裂解作用,溶解吞噬体膜，从而阻止或延长吞噬泡酸化的时间，并使细菌逃离吞噬体中的杀菌物质,进入宿主细胞胞浆。这个过程主要由李氏杆菌溶血素LLO和磷脂酶两类毒素分子直接介导。通过溶解细胞吞噬体膜而使LM逃离吞噬体，促进菌体进入胞浆而得以扩散，可被胆固醇和氧化剂所抑制。不仅能在LM逃逸初级吞噬体时发挥作用，同时也是LM逃逸两层膜吞噬体过程中所必须的。进一步研究表明，LLO能直接与细胞膜表面分子结合后插入细胞膜中，形成直径为20-20nm通道。调节巨噬细胞因子表达，诱导树突状细胞凋亡的作用。LLO在IFN-beta的作用下，可以增加巨噬细胞细胞膜的通透性并加速细胞凋亡。1、李氏杆菌溶血素(listeriolysionO,LLO)2、磷脂酶(phospholipases)磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC）磷脂酰胆碱磷脂酶C（PCPLC）plcA基因编码具有磷脂酰肌醇特异性毒性相对小，对细菌在细胞间扩散作用不大plcＢ基因编码可水解鞘磷脂在内的各种磷脂功能复杂磷脂酶PLC是致病性李氏杆菌的重要毒力因子，LM能产生2种C型磷脂酶。磷脂酶PLC是致病性李氏杆菌的重要毒力因子而脂类是细胞膜的主要成分,磷脂酶C能降解脂类破坏细胞膜使细菌从吞噬泡中逃逸出来。ⅢLM在细胞与细胞间传播三、LM在细胞与细胞间传播李氏杆菌进入非吞噬细胞是通过一种“拉链模式”来实现的。它之所以能侵袭宿主细胞与细菌本身产生的内化素有关。1、内化素（Internalin）是LM侵入不同组织细胞的关键因素。内化素作为LM的表面粘附配体与组织细胞的表面受体结合，使LM粘附在细胞表面，激活胞内信号通路，从而完成入侵过程。2、肌动蛋白聚合蛋白(Actinpolymerzingprotein，ActA)细菌的运动性是肌动蛋白聚集在细菌尾部而获得的,单一的菌体蛋白就足以催化宿主细胞肌动蛋白纤维素的聚合，引起肌动蛋白聚集形成聚合物,为细菌运动提供动力,这个菌体蛋白就是ActA。当李斯特菌进入宿主细胞质时，肌动蛋白微丝聚集在李斯特菌的周围，当此细菌向细胞膜运动时，肌动蛋白微丝在细菌后面形成彗星状尾巴。此肌动蛋白尾巴以某种方式跟着细菌移动。研究发现，用肌动蛋白抑制剂处理该彗星尾巴，可以使李斯特菌停止运动。LM入侵细胞经胃肠道感染进入宿主细胞内吞小泡进入宿主细胞胞浆增殖极向运动形成双膜结构并逃逸二级吞噬体内化被包裹逃逸吞噬吸收宿主细胞营养聚集、激活肌动蛋白LM菌在细胞与细胞间传播ⅣLM病的流行情况四、李斯特菌病的流行情况李氏杆菌多数散发存在，直到1981年在加拿大食用由LM感染的蔬菜引起的第一次大流涉及超过100人：其中34个孕妇感染、9个死胎，77个成年人有明显的疾病。据美国疾病防控中心的最新统计，截至2011年9月28日，美国已有18个州72人因食用受李斯特菌污染的甜瓜而染病，至少13人死亡。7日内因食用“毒甜瓜”死亡的人数升至21人；在美国，每年发生李氏菌性脑膜炎和脓毒血症的病例达1700例；在加拿大的10个省份中有8个省报告有李氏菌病感染病例李斯特菌病的流行病学LM李氏杆菌菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青贮饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。季节性•多发生于夏秋两季6-9月为发病高峰。11月至次年2月极少发病。地区分布•多发生于发达国家，主要以散发性为主。易感人群•易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人，免疫功能缺陷者。宿主•牛、羊、禽、兔、鹿等。牛羊易感。宿主死亡率•引起侵袭性疾病的发生率比较低但其死亡率高达20%～30%，因此对健康危害较大。ⅤLM病的临床表现1、致病性•李氏杆菌病是由产单核细胞李氏杆菌引起的人和多种家畜、家禽、啮齿动物共患的散发性传染病。家畜主要脑膜脑炎、败血症（妊娠母畜流产）;家禽、啮齿动物表现为坏死性肝炎、心肌炎，有的还可出现单核细胞增多.•LM进入人体是否得病与菌量和宿主的年龄免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能，因此，易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人，免疫功能缺陷者。健康成人个体出现轻微类似流感症状新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、出血性皮疹、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡反刍动物人类单胃动物李斯特菌病的临床表现ⅥLM病的预防与防治远离疾病，病从口入1.彻底煮熟动物生肉，如牛肉、猪肉、家禽肉。2.食用生蔬菜时，要彻底洗干净3.生、熟食品分开存放。4.避免饮用生牛奶（未经低温消毒处理）或食用生牛奶制成的食品。5.在处理完未煮熟食物后，要将手、刀和砧板洗干净等6.如果及早诊断,抗生素治疗的孕妇或免疫力低下的个体可以防止疾病的严重后果。抑制该菌的抗生素包括氨苄青霉素、万古霉素、环丙沙星、和阿奇霉素•。LM仍存在的问题为什么LM容易感染脑部和胎盘?为什么在孕妇LM更倾向于感染胎盘?基因表达受到哪些因素的影响、在通过何种信号通路调控等？LM内是否还存在其他的调节系统?如果有，与宿主的先天性免疫有何关系?.存在的问题无疑，对这些问题的研究有助于加深对病原和宿主之间相互作用的认识。相信随着对LM的深人研究，我们会更加深人和全面地了解病原菌的致病机制，为更好地控制重大疾病提供依据。L/O/G/OThankYou!穿刺接种半固体动力培养基，室温（20～25℃）培养2～5d，逐日观察。有动力。自穿刺线向四周蔓延生长，呈典型伞状生长，底部为弯月牙状。动力试验过氧化氢酶：过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解成氢和氧。菌落－平板－1滴3％的过氧化氢。生化试验尿素酶（Urease）试验穿刺接种尿素琼脂斜面，35℃培养5d，逐日观察阴性。有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色；。1、未接种2、尿素酶阳性3、尿素酶阴性MMA平板OXA平板挑取5个可疑菌落，接种TSA-YE平板，进行纯培养。纯化菌落再转接到TSB-YE肉汤，35℃培养24h。进行生化试验。分离蓝色或者兰灰色，扁平圆润，稍有凸起，边缘整齐，菌落较小，约为0.5mm左右。划线接种于MMA或者OXA平板，35℃培养24～48h。斜射光镜检。菌落呈黑色，直径1mm，在其周围形成一个黑色环。PALCAMCHROMagar2mm灰绿色中心黑色凹陷，菌落周围呈棕黑色水解圈蓝色菌落周围呈白色晕圈舌麻痹而引起的流涎、脱水而引起的眼窝凹陷病牛眼睑麻痹肿胀而引起的角膜炎病牛严重的斜颈和倒地不起的病牛局部麻痹所引起的左侧耳朵下垂的病牛•初患牛突然出现食欲废绝、精神沉郁、低头垂耳、轻热、不随群行动等症状由于舌和咽部麻痹，水和饲料都不能咽下。不久就出现头颈一侧性麻痹和咬肌麻痹可见大量持续性的流涎，最后倒地不起，发出呻吟声，病牛死于昏迷状态。孕牛发生流产；病程短者2～3d，长者1～3周或更长。•猪：表现运动失调，无目的行走或后退，前、后肢张开呈观星姿势肌肉震颤、僵硬，阵发性痉挛，侧卧时四肢做游泳状。仔猪以败血症为主，表现体温升高、咳嗽、呼吸困难、腹泻、有的有神经症状，病发率较高。病猪感染后表现角弓反张的神经症状•早产儿感染发病时，主要表现呼吸急促、黏膜发绀、呕吐、尖叫和抽搐等；1～3周龄的病儿则呈现拒食、高热、和昏迷等症状；人在感染后3-70d出现症状，健康成人可出现轻微类似流感症状，易感者突然发热，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产。李斯特病者的胎儿患者的皮肤单核细胞增多脑膜脑炎型可见脑充血，水肿，脑脊髓液增加，混浊，血管周围有以单核细胞为主的细胞浸润MMA(李氏菌选择性培养基)作用：单核细胞增生李斯特氏菌的选择性分离培养原理：胰胨、多价胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供碳源；氯化钠维持均衡的渗透压；磷酸氢二钠为缓冲剂；甘氨酸、氯化锂、苯乙醇和复达欣可抑制非李斯特氏菌以外的部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；琼脂是培养基的凝固剂.配方：胰胨多价胨牛肉膏粉葡萄糖氯化钠磷酸氢二钠甘氨酸氯化锂琼脂最终pH5g5g3g1g5g1g10g0.5g15g7.3±0.2PALCAM琼脂用途：用于单增李氏菌选择性分离（FDA标准）原理：蛋白胨提供生长必须的碳氮源；酵母膏粉和淀粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠可维持均衡的渗透压；葡萄糖提供碳源；李斯特氏菌水解七叶苷与铁离子反应形成黑色的6,7-二羟基香豆素；甘露醇是可发酵的糖，酚红是pH指示剂；氯化锂和其它的抗生素能抑制革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌；琼脂是培养基的凝固剂。配方：（g/L）蛋白胨可溶性淀粉酵母浸粉D-甘露醇七叶苷柠檬酸铁铵D-葡萄糖氯化锂琼脂氯化钠酚红pH值23.01.03.010.00.80.50.515.013.05.00.0825℃CHROMagar™法国科玛嘉李斯特菌显色培养基用途：用于分离和鉴定单核增生李斯特菌成分（g/L）琼脂蛋白胨和酵母浸出物NaCl色素pH15.023.05.017.57.0±0.2OXA—牛津琼脂用途：用于食品和药品中单增李氏菌的分离培养原理：蛋白胨提供氮源和氨基酸，可溶性淀粉消除一些毒性物质，氯化钠维持渗透压，琼脂是凝固剂，氯化锂抑制革兰氏阴性菌生长，混合抗菌剂抑制除李氏菌外的革兰氏阳性菌生长，李氏菌分解七叶苷与铁离子结合形成黑色菌落，并在菌落周围形成棕色的环。配方：特殊蛋白胨可溶性淀粉氯化钠琼脂七叶苷柠檬酸铁铵氯化锂pH牛津琼脂添加剂23.01.05.013.01.00.515.07.0±0.2℃5ml/支TSA-YE(胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂)作用：用于单增李氏菌的分纯，培养，可用于做7%羊血琼脂（SN标准）原理：胰胨、多价胨和酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；葡萄糖提供碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；琼脂是培养基的凝固剂。配方（每升）：胰胨17g多价胨3g酵母膏粉6g氯化钠5g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g琼脂15g最终pH7.3±0.2TSB-YE（胰蛋白胨大豆肉汤培养基）作用:用于细菌的培养，特别用于食品中李斯特氏菌的增菌培养。原理：胰胨、多价胨和酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；葡萄糖提供碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；萘啶酮酸和盐酸吖啶黄为选择性抑菌剂，抑制非李斯特氏菌生长。配方（每升）：胰胨17g多价胨3g酵母膏粉6g氯化钠5g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g最终pH