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项目四丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备任务1SHMT电泳制备方案的制定张家敏生药11212011423225第六组简介•聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂又称为共聚体的N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE）。•与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。③对pH和温度变化较稳定。④几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。⑤样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。⑥凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。⑦分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性•2．凝胶孔径的可调性及其有关性质（1）凝胶性能与总浓度及交联度的关系：凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。通常用T%表示总浓度，即100ml凝胶溶液中含有Acr及Bis的总克数。Acr和Bis的比例常用交联度C%表示，即交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数。根据有关实验研究，可知当T%值固定时，Bis浓度在5%时孔径最小，高于或低于5%时，孔径却相应变大。为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Acr浓度，Bis和Acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液pH值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。•（2）凝胶浓度与被分离物分子量的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的分子量也不同，在操作时，可根据被分离物的分子量大小选择所需凝胶的浓度范围。也可先选用7.5%凝胶（标准胶），因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。SDS-PAGE的影响因素•1.带电颗粒的性质•净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多，直径小而且近于球状，则泳动速度快，反之则慢。•2.电场强度（电位梯度）•指单位长度（cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压（常压）电泳100—500V，电场强度为2—10V/cm，分离时间需要数小时、数天或更长。高压电泳500—1000V，电场强度20—200V/cm，电泳时间短。有时仅需几分钟，主要用于氨基酸、肽、核苷酸。由于电压增高电流增大需要冷却装置。•3.溶液的PH•溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度。也决定物质所带净电荷的多少。对氨基酸、蛋白质等两性电解质而言，溶液PH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，电泳速度越快。反之越慢。血清中：白蛋白pI4.0；α2球蛋白pI5.06；β球蛋白pI5.1；γ球蛋白pI7.1。在pH8.6的缓冲液中电泳时，都带负电荷，其泳动速度为：白蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白。为了利于分离蛋白质混合液，应选择一种使各种蛋白质所带电荷差异明显的pH值。•4.溶液的离子强度•在保持足够缓冲能力的前提下，离子强度要求最小。溶液离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常选择在0.05—0.1mol/l之间。缓冲溶液离子强度可通过下列公式计算：I=0.5ΣcZ2；I—溶液的离子强度；c—离子浓度；Z—离子价数。如:0.154mol/l的NaCl溶液的离子强度。I=0.5（0.154﹒12+0.154﹒12）=0.154。•5.电渗作用•在有支持物的电泳时影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。电渗作用：在电场中，溶液对固体支持物的相对移动。电渗作用根据支持介质的不同而产生不同程度和不同方向的电渗流动。因此电渗作用与电泳速度关系密切。电泳基本原理•蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。•聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。试剂•1、30%凝胶贮备液：称取29g丙烯酰胺（Acr）和1g甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100ml，滤纸过滤贮存。•2、10%SDS：称取SDS10g加蒸馏水至100ml。•3、10%过硫酸胺（AP）•4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）•5、5×电泳缓冲液：于900ml蒸馏水中分别加入15.1gTris、94g甘氨酸、5gSDS，混匀后加蒸馏水至1000ml。•6、1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)和1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)•7、电泳加样缓冲液器材•移液枪•垂直电泳槽•电泳仪•移液管操作步骤•1、配制分离胶浓度8%、体积15mlH2O6.9ml30%凝胶贮备液4.0ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)3.8ml10%SDS0.15ml10%过硫酸胺0.15mlTEMED0.01ml•2、一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。•3、聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。•4、配制5%成层胶5ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。H2O3.4ml30%凝胶贮备液0.83ml1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8)0.63ml10%SDS0.05ml10%过硫酸胺0.05mlTEMED0.01ml•5、在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3min。•6、成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。•7、加样•8、电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。•9、取下凝胶，固定、染色或进行Westernblot分析。