北大医学研究生课程-分子免疫学-细胞因子和细胞因子受体-王璐教授

细胞因子和细胞因子受体CytokineandCytokineReceptor北京大学人类疾病基因研究中心王露细胞因子概念•细胞因子（Cytokine）是指由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长、分化、调节免疫功能和生理反应并参与病理反应的小分子蛋白质。细胞因子从细胞中释放出来成为重要的可溶性信使蛋白，它是细胞间信号网络的组成部分。在免疫系统，这一网络调控天然免疫和特异性免疫应答中各种功能性事件，如炎症反应、防御病毒感染、特异性T、B细胞增殖及功能调节。细胞因子研究历史•1957年，发现干扰素（IFN）•1969年，提出淋巴因子（lymphokine）的概念•1974年，定名细胞因子（cytokine）•近年来，细胞因子发展迅猛，现已发现200多种细胞因子，成立专门的细胞因子学会，如国际细胞因子学会（internationalcytokinesociety）；创办研究细胞因子的专门杂志，如《Cytokine》等。人类基因组研究显示，不仅有新成员存在于已有的细胞因子家族中，还会找到全新的家族，尚有多种细胞因子有待发现。怎样确定一种物质是细胞因子？•从人类基因组发现新细胞因子由于体内含量较高的细胞因子大部分已被克隆化，传统的路线已经难以发现新免疫分子。目前的新细胞因子克隆化策略主要利用反向生物学原理，从人类基因组发现新细胞因子或其受体编码基因。传统生物学策略发现生物活性－鉴定细胞因子蛋白－克隆基因－细胞表型－动物模型－人体内功能及与疾病关联反向生物学策略数据库DNA序列－生物信息学－蛋白质表达－细胞表型－动物模型－人体内功能及与疾病关联。•细胞因子序列同源性分析和基因Cluster分析[IL-19·20·23·27·30·33·35,IL-17B-F(包括IL-25)，IL-1F5-F10]•免疫细胞基因和蛋白表达谱分析（IL-21·22·26·28A/B·29·31·32·34）•免疫相关疾病的易感基因或致病基因分析(IL-24)•利用免疫细胞筛选模型，开展基因表达文库或RNAi文库的功能筛选新的细胞因子的发现免疫细胞筛选技术生物信息学基因芯片酵母双杂交蛋白质组学结构基因组学动物体内实验基因敲除转基因小鼠功能研究药物开发研究其它应用研究免疫细胞筛选技术在发现细胞分子研究的重要位置筛选潜在的细胞因子的策略•未知蛋白的生物信息学分析：–无功能性文章报道或无免疫相关的功能性报道–具有潜在的信号肽或被证实为分泌蛋白–蛋白氨基酸数目少于300个–主要在免疫系统和造血系统中表达7获得的基因，ORF克隆连接在真核表达载体转染293T细胞，检测其分泌表达Th1Th2Th17TregCD4+CD45RA+naïveTcellsPBMCAnti-CD3,anti-CD28,IL-1b,IL-6,TNF-a,IL-23,anti-IFN-γ,anti-IL-4Anti-CD3,anti-CD28,IL-12,IL-2,anti-IL-4Anti-CD3,anti-CD28,IL-4,IL-2,anti-IFN-γ,anti-IL-10Anti-CD3,anti-CD28,IL-2,TGF-βIFN-γT-betIL4,IL-5,IL-13GATA-3IL-17A,IL-17F,IL-22,IL-26RORγtCD25FoxP3DifferentiationindexProliferationindexApoptosisindex[3H]Thymidineincorporationassay、BrdU、CFSEAnnexinVExpressionprofileofnovelgeneAddthesecretedprotein在免疫细胞中，检测其生物学功能•正常细胞：–未活化时，产生很少；–活化后，产量可提高成百上千倍；如活化的淋巴细胞、活化的单核/巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等。IL-1、IL-6、IL-12、IL-18和TNF—主要由巨噬细胞产生的细胞因子细胞因子的来源•肿瘤细胞–如Jurkat细胞(IL-2,3)、骨髓瘤细胞(IL-6)、WEHI-3(IL-3)等。•基因工程技术–从工程细胞如大肠杆菌、酵母菌等产生重组细胞因子。细胞因子的分类根据产生细胞因子的细胞种类分类：1、淋巴因子(lymphokines)2、单核因子(monokines)3、非淋巴因子、非单核因子/巨噬细胞产生的细胞因子：基质、血管内皮、成纤维细胞等根据细胞因子的结构和功能分类1、白细胞介素(Interleukin,IL)2、集落刺激因子(Colony-StimulatingFactor,CSF)3、干扰素(Interferon,IFN)4、肿瘤坏死因子(Tumor-NecrosisFactor,TNF)5、趋化因子(Chemokine,CK)6、生长因子(GrowthFactor,GF)7、转化生长因子家族（TGF-b)1.白细胞介素(Interleukin,IL)1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上命名的，将由白细胞产生的又在白细胞之间发挥作用的细胞因子统一命名为白细胞介素，正式命名的有IL-1--IL-35。Interleukin来自inter-leukin，意指白细胞之间信使分子，中文译为白细胞介素。白细胞介素的分类•IL-1家族：IL-1α/β·1Ra·18·33•IL-2家族：IL-2·4·7·9·15·21(共用γ受体链)•IL-6家族IL-6·11·27·30·31(共用gp130受体链)•IL-10家族IL-10·19·20·22·24·26·28A/B·29(结构相似)•IL-12家族IL-12·23·27·35(均为异源二聚体结构)•IL-17家族：IL-17A、B、C、D、E和F[1]。•集落刺激因子IL-3·1·5·6·11•IL-8（趋化因子）•其它IL：IL-13·14·16·32·34传统生物学策略生物活性蛋白质基因细胞动物模型人体内功能及与疾病关联分离纯化cDNA克隆检测表型构建临床相关反向生物学策略DNA蛋白质细胞动物模型人体内功能及与疾病关联检测表型构建临床相关疾病标本DNA致病基因或易感基因分析IL-2•1976发现,1979年命名,1983年克隆成功•1965年发现混合白细胞培养上清中存在一种可溶性因子，可促进细胞生长，命名为母细胞形成因子（BlastogenicFactor，BF)•1976年发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，故称为T细胞生长因子（Tcellgrowthfactor，TCGF）•1979年统一命名为白细胞介素2（interleukin2，IL-2）•IL-2别名–BF(blastogenicfactor);Costimulator;EDF(eosinophildifferentiationfactor);KHF(killercellhelperfactor);LMF(lymphocytemitogenicfactor);LCMfactor(lymphocyte-conditionedmediumfactor)LPF(lymphocyteproliferationfactor);MAF-CI(macrophage-activatingfactorforcytotoxicityI);PFC-EA(plaqueformingcellenhancingfactor);SCIF(secondarycytotoxicT-cellinducingfactor);TCGF(T-cellgrowthfactor);TCPA(Tcolony-promotingactivity);TDF(thymocytedifferentiationfactor);TMF(thymocytemitogenicfactor);TMF(T-cellmaturationfactor);TMF(T-cellmitogenicfactor);TRF-3(T-cellreplacingfactor-3);TSF(thymocytestimulatingfactor).•1983年Taniguchi从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功–IL-2含有133aa，分子量为15.5kDa–N端有糖基化修饰–三个半胱氨酸：58、105、125位•IL-2主要产生细胞：–主要由活化CD4+Th1分泌,CD8+T和NK也能产生–T细胞肿瘤细胞系:如人Jurkat和小鼠EL-4–T淋巴细胞杂交瘤:FS6-14.13、HT-24A等•IL-2受体：CD25(α)；CDl22(β)；CDl32(γc)IL-2的生物学活性•作用具有沿种系谱向上有约束性，向下无约束性：1、促进活化的T细胞进入S期，维持细胞的增殖，刺激产生：MHCII，IFN-γ，IL-4、5、6，LT-α，CSF。2、促进杀伤细胞分化和效应：CTL，NK，LAK；诱导杀伤细胞：IFN-γ，TNF-α产生，增强CTL穿孔素表达3、直接、间接作用于B细胞：促进增殖分化，Ig分泌4、促进巨噬细胞通过ADCC机制杀伤肿瘤IL-2主要生物学活性•白细胞介素2超家族:oneimportantfamilyoftypeIcytokinesisthecommoncytokinereceptorγ-chain(γc)family,whichconsistsofIL-2,IL-4,IL-7,IL-9,IL-15andIL-21,andissonamedbecausethereceptorsforthesecytokinesshareγc(alsoknownasIL-2RγandCD132)YrinaRochmanetal.NatureImmunology.2009.9：480-4902.集落刺激因子(Colony-StimulatingFactor,CSF)•能够刺激多能造血干细胞和不同发育阶段的造血祖细胞增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。•根据刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞有不同的命名G-CSF(粒细胞集落刺激因子)•1983年命名,1986年克隆成功.•人G-CSF基因位于17号染色体,•人类有两种不同的G-CSFDNA,分别编码含207和204个氨基酸的前体蛋白,均有30个氨基酸的先导序列,除了在35位插入了3个氨基酸外,其余序列相同.•有5个半胱氨酸36=42,64=74,17游离.•来源•多种细胞可产生–内毒素、TNF-α、IL-1、IFN-γ活化单核/巨噬细胞可产生，–刺激成纤维、内皮细胞也可产生，–某些肿瘤细胞可产生生物学活性•主要作用于中性粒细胞谱系造血细胞的增殖、分化和活化•对人粒细胞、单核细胞、成纤维、平滑肌细胞等有趋化作用。G-CSF与临床1、粒细胞减少症2、肿瘤化疗引起血细胞减少症3、贫血和骨髓发育异常综合症3.干扰素(Interferon,IFN)•具有干扰病毒感染和复制功能的细胞因子。•1957年从病毒感染细胞培养中分离到一种生物活性物质，因它可以干扰其它病毒的复制而被命名为干扰素。干扰素的命名•20世纪60年代根据来源及对酸的耐受程度，将干扰素分成I和II型；–I型(IFN-α，IFN-β)耐酸，pH2活性稳定，其中白细胞产生的称白细胞干扰素，成纤维细胞产生的称成纤维干扰素；–II型(IFN-γ)不耐酸，是抗原或有丝分裂原刺激PBMC产生又叫免疫干扰素；•80年代又将其称为IFN-α，IFN-β，IFN-γ；•IFN-α是异质性的，包括14个亚型，编码基因成串排列在9p23，产物高度同源。•IFN-α、IFN-β均定位9号染色体，单外显子；•许多刺激剂可活化基因表达；•IFN-α、IFN-β分子结构有相似之处；•成熟的IFN-α各亚型有166个氨基酸(IFN-α2165个),高度同源,4个保守的半胱氨酸。•成熟的IFN-β有166个氨基酸,3个半胱氨酸•成熟的IFN-γ由143个氨基酸组成，以同源双体形式存在，对酸不稳定。生物学活性IFN-α和IFN-β1、抗病毒活性：诱导抗病毒蛋白：2-5A合成酶--催化