园艺植物生物技术第六章

Chapte6BasicTechnologyforRecombinantDNAwehavebeenfacinggeneticimpromentformanycharatersofhorticultureplants。crossbreeding(backcross)育种周期长；有利于有害基因连锁；基因资源受限。GeneticImprovementmethodsMutationBreedingRandomly/can'tbecontroledSomaticHybridization：GeneticEngineering精确、可控、无物种限制SelectioninBreedingphenotype-based：P=G+Emoleculeassistedselectionhereditaryfact（Mendel）↓chromosome（Morgan）↓DNA↓Gene准确、不受发育阶段限制。ContensNucleicacidextractionGelelectrophoresisPolymerasechainreaction(PCR)MolecularhybridizationDeoxyribonucleicacid，DNA)RibonucleicAcid，RNAmRNArRNAtRNA生物遗传的物质基础，决定了生物体的遗传、变异、生长和发育。基因工程和分子标记主要的研究对象。核酸的质量（纯度、完整性）直接关系到研究的成败。Nucleicacid(DNAandRNA)1.NucleicAcidExtrationgenomicDNA核DNA线粒体DNA(mtDNA)叶绿体DNA（ctDNA)1.1DNAExtrationMethod1.1.1CTABmethod注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种阳离子去污剂。在高离子强度的溶液中(0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。加入乙醇使核酸沉淀，通过离心分离核酸，而CTAB溶于乙醇/异丙醇除去。DNA大小20~50Kb，适用于多糖含量高的植物材料。CTABExtractionBuffer组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，处于液相中;CTAB溶解细胞膜，并结合蛋白、多糖，便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除ModifiedCTABExtractionBuffer组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。50ml离心管中加入10ml提取缓冲液，65℃预热冻粉转至提取缓冲液中，保温30min，期间轻柔搅动加入等体积氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀,静置10min,10000rpm离心10min取上清液，加入2/3体积的异丙醇，混匀，室温放置15min10000rpm离心10min，去上清，70%乙醇冲洗2次，风干用TE溶解DNA,然后低温保存液氮(Liq.N2)罐研钵(mortar)移液枪(pipettor)称取1~2g新鲜叶片，液氮研磨成粉procedureCentrifuge(离心机)waterbath(水浴锅)1.1.2SDSmethodSDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇（ethanol）沉淀水相中的DNA。可提取到大于100kb大分子DNA.SDSExtrationBuffer组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%Procedure1.取幼嫩材料0.2g，洗净，吸干表面水分，放入预冷研钵中，加液氮研磨至粉末状，转移粉末到1.5ml离心管中。2.向管中加入900μLSDS提取缓冲液，轻轻混匀，再加入100μL10%SDS，充分混匀，65℃保温10~15min（期间晃动2-3次）。3.加入160μL5mol/LKAc，混匀，置冰上30min。4℃,12000rpm离心15min,转移上清到一新离心管中。4.加等体积的氯仿/异戊醇，混匀后，静置10min，10000r/min离心10min，转移上清液。5.加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min。6.用70%乙醇洗涤沉淀DNA3次后，晾干。7.加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA，低温保存。Attention：Simplifying:缩短过程，减少对核酸破坏；Reducingdamagebychemical:操作在pH4－10条件下（过酸过碱破坏磷酸二脂键）；Reducingdamagebyphysicalfactors:包括机械剪切力，高温，所以常规操作0－4℃；Avoidingdegradationbynuclease:DNA酶需要Mg2+,Ca2+激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙二酸(EDTA)，柠檬酸。•Materialpreparation：thefresherthebetter,aviodingrepeatedfreezingandthawing。•Celllysis：材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。高温温浴时，定时轻柔振荡。DNAprecipitate：异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇，但异丙醇容易将盐成分一起沉淀，且异丙醇难以挥发除去。•DNAdissolved：若长期储存,建议使用TE缓冲液溶解。1.2RNAExtrationmRNArRNAtRNAsnRNAAvoiddegradationbyRNAaseInhibitingexogenousRNAase：水、溶液、塑料制品等：0.05%~0.1%DEPC(焦炭酸二乙酯）37℃处理12h，最后用高压灭菌去除残留DEPC。玻璃器皿：200℃烘烤3h以上。InhibitingendogenesisRNAase：Proteaseinhibitor（酚、氯仿、异硫氰酸胍）RNAaseinhibitor（氧钒核糖核苷复合物、RNAasin)1.2.1ExtractionfortotalRNA苯酚（phenol）法：苯酚协助破碎细胞；酚/氯仿变性蛋白并反复抽提核酸；3mol/L乙酸钠沉淀RNA；4-氨基水杨酸与三异丙基萘硫酸盐抑制RNAase活性。异硫氰酸胍（Guanidiniumthiocyanate）法•异硫氰酸根与胍离子是很强的蛋白质变性剂。异硫氰酸胍与十二烷基氨酸钠合用可使核蛋白体迅速解体；与β-巯基乙醇合用使RNAase活力低下。•三者合用，强有力地抑制RNA酶降解，增加了核蛋白体的解离，将大量的RNA释放到溶液中。•然后用酸性酚（pH=3）进行抽提，既保证了RNA稳定，又抑制了DNA解离，使DNA与蛋白质一起沉淀，RNA被抽提进入水相。•用异丙醇沉淀RNA，经酚/氯仿再次抽提进行纯化。Procedure①25mL离心管中加入15ml异硫氰酸胍4mol/L溶液,冰上预冷；②取2.5g新鲜的幼嫩植物组织放入研钵，加液氮迅速研磨成粉末。将粉末转入预冷离心管中，震荡混匀，置冰上。③加入2mol/LNaAC1.5ml、水饱和酚15ml和氯仿/异戊醇3ml，每加入一种试剂都轻轻摇晃离心管混匀，冰浴15min。④4℃下15000g离心30min，将上层水相转移至另一干净离心管中，向管中加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃冷冻1h.⑤4℃下13000g离心25min，小心去除上清液，沉淀溶于5ml异硫氰酸胍溶液中，再加入等体积的异丙醇，混匀-20℃冷冻1h.⑥4℃下13000g离心20min，沉淀用70％乙醇洗一遍，稍微晾干后，溶于适量体积（500μl）DEPC处理的水中。检测后分装，-70℃保存。1.2.2IsolationofmRNA总RNA流经Oligo(dT)纤维素层析柱；高盐缓冲液（0.5mol/LNaCl）下，mRNA3’端poly(A)残基与连接在纤维素层析上的Oligo(dT)配对，形成氢键，使mRNA被吸附在柱上。最后用低盐缓冲液或蒸馏水洗脱。2.GelElectrophoresis2.1Agrosegelelectroresis琼脂糖凝胶电泳Agrose(琼脂糖)：linearpolymerextractedfromseaweed.Agrosegelarecastbymeltinginthedesiredbuffer.Onhardening,theagroseformsamatrix.Whenanelectricfieldisappliedarossthegel,DNAmigratestowardstheanode.浓度越高→孔隙越小→分辨力越强。Buffer(缓冲液)：TAE：成本低，但缓冲量低，需经常更新。TBE：成本较高，但缓冲量大。TPE：成本较高，缓冲量大，易与DNA共沉淀。Separationsize：0.2~50kb.Fluorescentethidiumbromide（荧光染料溴化乙锭,EB）：能插入DNA的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫外光的激发下产生桔红色荧光。荧光强度与与核酸分子长度和含量成正比。灵敏度可达1～5ng。BecarefulEBisapowerfulmutagenandtoxic.Thestainingsolutionshouldbedecontaminatedafterituse.electrophoresisapparatus电泳仪electrophoresistank电泳槽GelDoc-ItImagingStation凝胶成像系统DNAelectrophoretogram电泳图谱高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象2.Polyacrylamidegelelectroresis聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺（Acr）+N,N’-亚基双丙烯酰胺（Bis）过硫酸铵TEMED聚合成凝胶（细网状）Specialty：分辨力强（5－500bp)；载样量大（1cm×1cm，10ug）；纯度高。Electrophoretogram电泳图谱ElectrophoresisapparatusElectrophoresistank电泳槽3、Polymerasechainreaction(PCR)聚合酶链式反应PCRwasinventedbyKaryB.Mullis,anAmericanscientistofHumangeneticresearchcenterofCetuscorp.in1983.HereceivedaNobelPrizeinchemistryin1993.Mullissaid,IdomybestthinkingwhiledrivingmyvehiclelateonenightwithmygirlfriendontheCaliforniamountainroad.3.1TheprincipleofPCRtempletsdNTPprimerBufferMg2+Initialdenaturation模