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中药材鉴别检测技术及残留相关要求成都中医药大学李敏028limin@163.com2013年11月成都中药材违法制假检测方法分析DNA分子技术在中药鉴定方面的应用中药材外观鉴别和检验检测技术二氧化硫残留量限量标准重金属等残留限量标准原子吸收法基本原理及相关要求主讲内容（一）制假特点一、中药材违法制假情况及检测方法分析高科技、高水平、高利润（暴利）（二）具体表现•掺假使假品种增加；•制、售假药的区域扩大；•制假手段、水平高，真假难辨；•贵细、濒危药材成为目前制假的主流。（三）制假手段仿真制作；增加重量；染色掺假；提取有效成分。1、仿真制作（1）利用一些外观形状和颜色相近的动植物进行制假掺假如被称为“万能假药”的牛蒡子根加工成升麻、人参、丹参；小天南星加工成半夏；炒后的葶苈子或党参籽充当车前子等。升麻牛蒡子根一、中药材违法制假情况及检测方法分析1、仿真制作（2）采用与原药材无关的原料经手工或机器加工出与药材外形相似的假药如用聚乙烯加工成假羚羊角、假穿山甲；用动物皮毛包裹填充物制成假麝香、假鹿茸；用面粉、石膏等加工模压成假冬虫夏草。蛤蟆油羚羊角及其塑料加工品明胶—蛤蟆油一、中药材违法制假情况及检测方法分析鉴别方法：经验鉴别、显微鉴别、理化鉴别示例1何首乌及其伪品的鉴定示例2大黄及其伪品的鉴定示例3附子及其伪品的鉴定一、中药材违法制假情况及检测方法分析2、增加重量（1）直接灌注杂质在药材中掺杂泥沙，碎石块、淀粉、糖、盐、白矾等物质。如紫河车填入淀粉、水泥、滑石粉；海龙、海马腹内灌入糊精、水泥；全蝎、土鳖虫掺盐掺矾以增重；冬虫夏草腹内插入铁丝、铅丝、竹签甚至灌注水银；穿山甲炮制品(甲珠)掺伪。鉴别方法：性状鉴别，重点水试一、中药材违法制假情况及检测方法分析（2）质地疏松的药材增重在中药材或饮片中渗入硫酸镁（重金粉）、白矾、明矾、硼砂等无机盐或在表面喷洒明矾、滑石粉等物质。如黄连、通草、桑白皮、远志、川断、升麻、苍术、北沙参、山药、粉葛、金银花、红花、芫花等。硫酸镁（加重粉）明矾金银花（加重粉）一、中药材违法制假情况及检测方法分析2、增加重量（3）质地紧密的药材增重在质地紧密的中药材或中药饮片表面涂布或喷洒琼脂、明胶、石灰粉等胶状物。如:赤芍、白芍、白芷、乌药、西洋参片、天麻片等均发现用此方法人为加重，有些僵蚕表面裹有大量胶水。西洋参明胶掺假明胶僵蚕石灰粉掺伪一、中药材违法制假情况及检测方法分析2、增加重量增重鉴别方法：掺伪品特点鉴别掺糖质重味甜水洗液煮沸后加碱性酒石酸钠试液，产生红色沉淀掺盐质重，味咸水洗液加硝酸呈酸性后加硝酸银试液，产生白色沉淀掺土质重，磣牙水溶后有泥土下沉掺矾质重，味酸而涩出现结晶，味涩不咸。水洗液加氢氧化钠试液，产生白色沉淀掺面粉色泽暗淡水洗液加碘试液，显蓝紫色掺滑石粉色乳黄，手捻光滑水溶后有白粉下沉掺石英粉质重，反光，磣牙水溶后有砂石下沉掺黄色染料色黄鲜艳水溶液染黄，花腿色掺硫酸镁质重，味咸量多呈现亮晶，味咸；量少可以用钡盐反应掺非药用部分有大量叶，梗等肉眼或显微镜下可检出2、增加重量一、中药材违法制假情况及检测方法分析共性鉴别：性状鉴别、总灰分检查、镁盐及铝盐检查（水浸液，加浓氨水2滴，溶液不得出现明显浑浊。）3、染色掺假(1)中药材掺假染色的主要方式和品种•造假染色：西红花、血竭、朱砂等•增重掺假染色：红花、冬虫夏草、青黛等•劣质药材染色：五味子、蒲黄、延胡索等•提取成分后染色：黄芩、姜黄、川乌等一、中药材违法制假情况及检测方法分析•染黄——人工牛黄、蒲黄、黄芩、姜黄、延胡索；•染红——红花、五味子、朱砂、血竭、鹿角；•染黑——冬虫夏草、水蛭、制川乌、制草乌、制首乌、胆南星；•染蓝———青黛；非法染色（2）已发现的掺假染色中药材品种及其色素品种检出掺伪染色物检测批数总阳性批数阳性率%西红花胭脂红、柠檬黄、金胺O、新品红433888.37黄柏金胺O7685.71全蝎柠檬黄433581.40松花粉碱性橙161168.75黄连金胺O11763.64人工牛黄胭脂红、金胺O、金橙Ⅱ261661.54朱砂808猩红543361.11红花胭脂红、柠檬黄、酸性红73、金橙Ⅱ1086459.26血竭808猩红、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅳ、松香酸382257.89白鲜皮总灰分异常13753.85蒲黄金胺O341852.94制草乌非正品522751.92乌梅柠檬黄、苋菜红、赤藓红、日落黄542750.00冬虫夏草苋菜红、808猩红、日落黄、亮蓝291448.28常用于中药材、中药饮片的染色惨假的化工色素有金胺O、金橙Ⅱ（酸性橙Ⅱ）、胭脂红、柠檬黄等。由于它们多数为非食用色素，特别是金胺O、金橙Ⅱ为可疑致癌物，对人体健康危害大，应注意鉴别。（3）中药材掺假染色检测的技术方法①中药材中黄色、橙黄色化工染料或色素的检测方法中药材蒲黄、黄芩、黄连、黄柏、延胡索、姜黄等易被金胺O、金橙Ⅱ、碱性橙、柠檬黄、亮黄、日落黄等6种黄（橙）色染料和色素染色。黄连、黄柏：、蒲黄、黄芩、延胡索中染色色素的检查：薄层色谱鉴别：以金胺O为对照品进行薄层色谱鉴别，在与对照品色谱相同位置不得检出相同颜色的黄色斑点；高效液相色谱法验证：不得出现与对照试剂色谱保留时间相同的色谱峰。必要时可采用高效液相色谱-质谱连用方法进一步验证。示例4蒲黄染色掺伪的鉴别一、中药材违法制假情况及检测方法分析（3）中药材掺假染色检测的技术方法②中药材中红色（含部分黄、橙色）化工染料或色素的检测方法中药材血竭、朱砂、西红花、红花、五味子、茜草等易被柠檬黄、胭脂红、苋菜红、赤藓红、酸性红73、金胺O、金橙Ⅱ、新品红、808猩红、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅳ等11种红色色素染色。药材薄层鉴别（对照品）高效液相色谱法验证红花柠檬黄、胭脂红、酸性红73、金橙Ⅱ不得出现与对照试剂色谱主峰保留时间相同的色谱峰。西红花金胺O、新品红、柠檬黄、胭脂红同上五味子胭脂红、赤藓红、酸性红73同上血竭808猩红、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅳ同上人工牛黄胭脂红、金胺O、金橙Ⅱ同上示例5红花染色掺伪的鉴别示例6五味子染色掺伪的鉴别示例7人工牛黄染色掺伪的鉴别示例8血竭染色掺伪的鉴别一、中药材违法制假情况及检测方法分析（3）中药材掺假染色检测的技术方法③中药材中水溶性色素的检测方法中药材冬虫夏草、乌梅、水蛭、全蝎、枸杞子、山茱萸等易被柠檬黄、胭脂红、苋菜红、日落黄、赤藓红、亮蓝、诱惑红等7种水溶性食用色素染色。冬虫夏草色素检查：薄层色谱鉴别：以胭脂红、苋菜红、日落黄、亮蓝为对照品进行薄层鉴别，在与对照品色谱相同位置不得检出相同颜色的斑点；高效液相色谱法验证：不得出现与上述对照试剂色谱主峰保留时间相同的色谱峰。乌梅色素检查：薄层色谱鉴别：以苋菜红、日落黄、亮蓝对照品进行薄层鉴别，在与对照品色谱相同位置不得检出相同颜色的斑点；高效液相色谱法验证：不得出现与上述对照试剂色谱主峰保留时间相同的色谱峰。必要时可采用高效液相色谱-质谱连用方法进一步验证。示例9正品冬虫夏草与古尼虫草的鉴别示例10乌梅染色掺伪的鉴别示例11青黛染色掺假的鉴别一、中药材违法制假情况及检测方法分析中药材掺假染色检测的技术方法•经验鉴别、理化鉴别——快速筛查•薄层色谱法——定性鉴别、常规检测•高效液相色谱法——定性鉴别、常规检测•液-质联用法——结构鉴定、方法验证4、提取有效成分很多中药提取成分后，外观性状未被破坏，又被返回市场重新销售，或掺入未提取药材中出售，极难发现。如大部分果实种子类及根及根茎类药材。药材提取物药材提取物药材提取物人参、西洋参总皂苷越桔原花青素山药薯蓣皂苷元虫草多糖淫羊藿双苷五味子总素红景天络塞维和红景天苷黄芪黄芪甲苷蛇床子蛇床子素何首乌总蒽醌枸杞、茯苓多糖玉米须黄酮黄连、黄柏小蘖碱山楂总黄酮当归蒿本内酯刺五加刺五加苷番泻叶皂苷生姜姜辣素苦瓜苦瓜苷荷叶荷叶碱猫爪草生物碱银杏叶银杏黄酮、内酯批把叶熊果酸石榴皮鞣花酸葛根葛根素虎杖白藜芦醇苦参总碱绞股蓝总皂苷酸枣仁总皂苷山楂叶牡荆素鼠李糖苷大黄大黄素等蒽醌白芍芍药甙百部百部碱连翘连翘苷水蛭水蛭素地龙蚓激酶葫芦巴葫芦巴碱补骨脂补骨脂素决明子决明素苍耳子苍耳苷升麻升麻碱等黄芩黄芩苷等黄酮类一、中药材违法制假情况及检测方法分析中药材违法制假检测方法如水试、火试鉴别牛黄、麝香，指纹图谱等中药材违法制假检测方法基原性状显微理化生物鉴定免疫鉴定法、电泳鉴别法及DNA分子标记等光谱检测鉴定如紫外、红外、荧光、原子吸收及质谱等先进仪器设备及技术如核磁共振波谱、扫描电镜、生物芯片等一、中药材违法制假情况及检测方法分析二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用1、DNA分子标记的类型分子标记以电泳技术和分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记-限制性片段长度多态性）以电泳技术和PCR技术为核心的DNA标记技术（RAPD标记-随机扩增的DNA多态性、AFLP标记-扩增片段长度多态性、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记、STS标记）以测序为基础的新型的分子标记（SNP标记、EST标记）及基因芯片等2、DNA分子标记的特点标记名称RFLPRAPDAFLPSSRISSRSCARSTSCAPs主要原理限制酶切Southern杂交随机PCR扩增限制性酶切结合PCR扩增PCR扩增随机PCR扩增特异PCR扩增特异PCR扩增PCR扩增产物限制性酶切多态性水平中等较高非常高高高中等检测基因组区域单/低拷贝区整个基因组整个基因组重复序列重复序列间隔的单拷贝区整个基因组单拷贝区整个基因组可靠性高中高高高高高高遗传特性共显性显性/共显性共显性/显性共显性显性/共显性共显性显性/共显性共显性DNA质量要求高，5-30μg中，10-100ng很高，50-100ng中，10-100ng中，2-50ng中，5-10ng高，50-100ng实验周期长短较长短短短短短开发成本高低高高低高高高二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用3、应用示例1——近缘种之间的鉴定•对红豆蔻及其混淆品（节鞭山姜、华山姜、假益智、多花山姜）的nrDNAITS区序列进行分析，成对比较时差异较大，可准确鉴定中药红豆蔻及其混淆品。•人参与西洋参及其他混伪品的DNA分子鉴定。•如甘草药用资源的整理与鉴定，采用RAPD分子标记方法比较4种甘草属植物光果甘草、乌拉尔甘草、刺甘草和刺果甘草的遗传关系。通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析，结果发现富含甘草甜素的光果甘草和乌拉尔甘草之间遗传关系非常相近。这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与植物分类学研究相吻合。方法：总DNA提取→构建富含SSR的文库→文库筛选→SSR特异性引物的设计→PCR扩增→多态性分析3、应用示例2—中药野生品与栽培品（养殖）的鉴定如利用简单序列重复(SSR)分子标记可以有效鉴定不同天麻居群（红天麻、乌天麻及黄天麻）的野生和栽培品种，并且利用相应引物均能很好地区分野生天麻、无性繁殖天麻及有性繁殖天麻，其中有性繁殖天麻均扩增出2条带，为杂合子；野生天麻及无性繁殖天麻只扩增出1条带，为纯合子。二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用3、应用示例3——道地性研究二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，自古以来以甘肃崛县一带为道地产区，所产当归药材质量最佳，习称“岷归”。应用RAPD技术对不同产地的当归样品进行分析，通过10个引物在每个样品中获得平均为55个的DNA片段，在此基础上构建18个不同产地当归样品的聚类树状图。进一步的分析表明，地理分布距离越小，当归的遗传差异越小；反之，越大；并且生态环境特别是小生境对当归遗传差异的作用不可忽视。因此药材的道地性不仅是一个地理意义上的概念，同时具有广泛的生物学内涵以及丰富的遗传特性。应用ISSR指纹标记技术对来自广西、广东、贵州、云南等省区的铁皮石斛的8个居群进行DNA分子鉴别研究，扩增得到127个条带，其中多态性条带115个，仅有2个引物产生的6个特异性条带可作为铁皮石斛8个居群鉴定的分子标记，由此建立了有效鉴定对铁