2005版药典无菌检查法方法验证及操作要点

2005版药典无菌检查法方法验证及操作要点饶春意1前言1.1定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。1.2实验环境条件要求无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。2.培养基2.1培养基的灭菌配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。2.2培养基的保存制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中一般可在一年内使用。2.3培养温度硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。改良马丁培养基置23～28℃培养。2.4培养基的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。2.4.1无菌性检查每批培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14天，应无菌生长。2.4.2灵敏度检查菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌株传代次数不得超过5代培养基接种每种菌接种至2管相应的培养基，另取一支不接种作空白对照，按规定温度时间培养。结果判断空白对照管应无菌生长，每种菌接种后的2管培养基管均生长良好，该培养基的灵敏度检查符合规定。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养3天；白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基中23～28℃培养5天。3.稀释液、冲洗液及其制备方法0.1％蛋白胨水溶液pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液4.方法验证试验目的:1)证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查2)确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。3)确保在实际检验条件下，该供试品的无菌检查法的准确性、有效性和重现性。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。4.1菌种1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]2）铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugznosa)[CMCC(B)10104]3）枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]4）生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]5）白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]6）黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]4.2菌液制备制备的菌液，一般当日使用。金黄色葡萄球菌（铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)营养肉汤（或营养琼脂培养基）生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃培养18～24小时；白色念珠菌改良马丁培养基（或改良马丁琼脂培养基）23～28℃培养24～48小时上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位)的菌悬液。黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数小于l00cfu的孢子悬液。4.3薄膜过滤法将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入试验菌（小于100cfu），过滤。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同上，作为对照.将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。金葡铜绿白念金葡铜绿白念加供试品对照管枯草生孢黑曲霉枯草生孢黑曲霉4.4直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接人小于l00cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于l00cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接人规定量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度培养3～5天。4.5结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用1)增加冲洗量，或增加培养基的用量，2)使用中和剂，或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。5.供试品的无菌检查5.1无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同5.2检验数量与检验量检验数量抗生素类药品没有单列开，抗生素类药与非抗生素类药品的最少检验量是相同的。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量，也不包括验证试验用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加l／2的最小检验数量作阳性对照用。只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。若采用直接接种法，应增加供试品1支(或瓶)作阳性对照用。检验量每份培养基接种供试品的量按表2、表3规定。表2上市抽验样品(液体制剂)的最少检验量供试品装量V(ml)每支样品接入每管培养基的最少样品量最少检验数量（瓶或支）最少检验数量（不含阳性对照试验）供试品检查（包括阳性对照试验）薄膜过滤法直接接种法≤11V55≤V2020≤V5050≤V10050≤V100（静脉给药）100≤V500V≥500全量半量2ml5ml10ml半量半量500ml20①10101010106620+1010+510+510+510+510+56+36+320+110+110+110+110+110+16+16+1表3上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量供试品装量M（瓶或支）每支样品接入每管培养基的最少样品量最少检验数量（瓶或支）最少检验数量（不含阳性对照试验）供试品检查（包括阳性对照试验）薄膜过滤法直接接种法M50mg50mg≤M300mg300mg≤M5gM≥5g一次性使用含药产品全量半量150mg500mg整个产品20①101010②1020+1010+510+510+510+520+110+110+110+110+15.4供试品处理及接种培养基5.4.1薄膜过滤法薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为l00ml，且总冲洗量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。水溶液供试品取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将l00ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份做阳性对照用。可溶于水的固体制剂供试品Β-内酰胺类供试品非水溶性制剂供试品油性供试品5.4.2直接接种法每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10％，同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于lOml。培养基的用量和高度同方法验证试验；每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。若符合直接接种法的供试品装量V(ml)，1V5时，规定最少检验数量为10支，即供试品作无菌检查时，最少检验数量为11支，以无菌操作各将11支供试品取半量分别接种于11管硫乙醇酸盐流体培养基中，取其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液（菌量小于l00cfu），作阳性对照，再将10支供试品中剩余的半量分别接种于10管改良马丁培养基中，按规定的温度和时间培养。可溶于水的固体制剂供试品Β-内酰胺类供试品非水溶性制剂供试品5.5培养含硫乙醇酸盐流体培养基的容器于30～35℃、含改良马丁培养基的容器于23～28℃,均培养14天。5.6结果判断符合规定供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。不符合规定供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。（不得复试）除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：(1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；(2)回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；(3)阴性对照管有菌生长；（4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。