七 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性

实验七金氏法测定血清谷丙转氨酶活性3.了解测定血清谷丙转氨酶活性的临床意义1.掌握金氏法测定血清谷丙转氨酶活性的原理2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定具体操作方法将α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α-酮基上，生成相应的酮酸与氨基酸的反应。催化这一反应的酶称为转氨酶。转氨作用：也称氨基转移酶，是一组催化氨基在-氨基酸与-酮酸之间转移的酶。是一种细胞内酶，当细胞膜通透性增加或细胞死亡时释放到血液中。转氨酶转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性均较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内两种酶维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。转氨作用的机制：体内主要两种转氨酶？谷丙转氨酶（GPT）又称丙氨酸转氨酶（ALT）谷草转氨酶（GOT）又称天冬氨酸转氨酶（AST）肝脏心脏谷丙转氨酶：催化谷氨酸和丙氨酸之间的转化的转氨酶，其结构式反应如下：血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义谷丙转氨酶广泛存在于机体各组织中。正常人血清中此酶浓度活性很低，肝细胞中该酶浓度活性极高，当肝细胞受损时此酶从细胞中释放血。因此测定血清ALT活性对于某些疾病的诊断和预后判断具有重要的参考价值。（1）血清ALT活性增高：肝胆疾病、药物和毒物（2）ALT活性降低：磷酸吡哆醛缺乏症。ALT在临床上主要用于肝脏疾病的诊断酶活性：是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量。即酶反应速度。酶活性的影响因素样品处理测定条件溶血抗凝剂存放时间温度pH时间底物浓度酶浓度常用的谷丙转氨酶酶活性测定方法有：1金氏法（King法）2赖氏法（Mohun法）3改良穆氏法（Reitman-Frankel法）共同点：原理、试剂、操作步骤和作用时间相似。不同点：在于单位定义和标准曲线绘制方法不同，因此测定结果的单位数值不同。在37℃,1ml血清与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸为1个活性单位第一步反应：第二步反应：520nmCH3α-丙酮酸2标准曲线的制备1测定酶活性试剂试管编号测定管对照管丙氨酸氨基转移酶底物液（ml）0.50.5置于37℃水浴中预温5min血清（ml）0.1置于37℃水浴60min——2,4一二硝基苯肼溶液（ml）0.50.5血清（ml）——0.1各管混匀后，置于37℃水浴中保温20min0.4mol/LNaOH溶液（ml）5.05.0混匀，10min后，30min内在520nm处比色，以对照管调零，读取测定管吸光度值。1测定酶活性取试管2支，按下表3-13操作表3-13试剂试管编号1234562μmol/L丙酮酸标准液（ml）——0.050.100.150.200.25谷丙转氨酶底物液（ml）0.500.450.400.350.300.250.1mol/L磷酸缓冲液(ml)相当于丙酮酸实际量（μmol）0.1000.100.100.100.200.100.300.100.400.100.50各管混匀后2,4一二硝基苯肼溶液（ml）0.50.50.50.50.50.5各管混匀后，置于37℃水浴中保温20min。0.4mol/LNaOH溶液（ml）5.05.05.05.05.05.0混匀，10min后，30min内在520nm处比色。以第1管调零，读取各管吸光度值。2标准曲线的制备取6支试管，编号，按下表3-12步骤操作：表3-12试管编号123456吸光度（A）丙酮酸含量（μmol）试管编号对照管测定管吸光度（A）表2丙酮酸标准曲线的绘制表1金氏法测定血清谷丙转氨酶活性原始数据记录1标准曲线图绘制1）用坐标纸绘制标准曲线2）标明操作人、时间、仪器型号和图表名称1.标准曲线图绘制1.标准曲线要过原点2.注明标准曲线名称:金氏法测定血清谷丙转氨酶活性3.注明横纵坐标的名称及单位4.注明分光光度计型号2血清谷丙转氨酶（ALT）活性的计算1）将测定管吸光度值代入求出相应的丙酮酸含量（μmol）2）根据丙酮酸含量计算每毫升血清中ALT活性单位数ALT活性单位数=生成丙酮酸的量×10在37℃,1ml血清与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸为1个活性单位1、加样的时候平行加样，减少操作误差，使得结果更加精确。2、标准丙酮酸溶液的加样一定要准确、减小实验结果误差。3、酶的活力测定与温度、时间影响很大，因此反应要严格控制温度和掌握时间。4、试剂盘中试剂与移液管的摆放一定要准确、防止交叉污染。谢谢！