3.质粒载体

质粒载体plasmid主要内容载体的概念及特点载体的分类质粒载体教学目标通过本节课的学习，学生要掌握载体的主要特点，其应该具备的元件，会灵活设计一系列的实验来证明宿主内转入了载体。第一节载体的特点一．载体的概念1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具），将外源DNA或者基因携带进入宿主细胞的工具。2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。二、载体应具备的条件在宿主细胞内能够进行自我复制，具备复制原点。有合适的限制性内切酶位点，每种位点最好有且只有1个，供外源DNA的插入且不影响其复制。有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验，便于筛选。有一定容量且有较高的拷贝数，易于制备。多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker三、载体的分类分类依据类别克隆扩增或表达举例按功能（1）克隆载体（2）表达载体√√PBR322PCDN3按进入受体细胞类型（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE√载体的分类克隆载体（cloningvector）都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。表达载体（Expressionvector）具有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。具有表达和调控能力的载体称表达载体。第二节质粒载体1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。一、质粒的生物学特性实验设计：把一个带抗性的质粒转化到一个不带抗性的宿主细胞中，如何区分转化进去质粒的细胞和没有转化进去质粒的细胞？3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500～700pACYC及其衍生质粒p15A10～212pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～20二、质粒上的标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记基因用于鉴别目标DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。筛选标记基因可用于将特殊表型的重组子挑选出来。筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。1选择标记基因(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene）(2)四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene）(3)氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene）(4)卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene）(5)琥珀突变抑制基因supF(6）其它还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活rr2筛选标记基因(1)α-互补（α-complementation）又称蓝白斑试验（IPTG-X－gal试验）α-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。诱导物ZYXPOZYXPO乳糖X-galLacZ蓝色化合物X-gal标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段(２)插入失活对于双抗性标记的质粒，当外源ＤＮＡ片段插入任何一个抗性基因中都会造成该抗性的丧失，从而筛选出重组子。pBR322质粒载体TetrAmprOripBR322质粒载体抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板三、质粒载体的种类发展阶段：第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。1质粒克隆载体用于扩增或保存DNA片段是最简单的载体。如：pBR322质粒载体符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。pUC18pUC19含四个部分：（1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）；（2）ampr;（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列；（4）多克隆位点（MCS）lacZ`OriAmprMCS2表达载体该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。能在体外转录克隆基因的质粒载体如何用质粒载体进行目的基因的克隆？Plasmid_Cloning.mov思考1.一个有效的载体应该具备哪些方法的特点？2.一个不含质粒的大肠杆菌做成感受态后，转化进入一个含有抗氨苄青霉素的载体，请设计一个实验筛选出含有载体的宿主。3.把一个外源基因插入以下载体，请设计实验获得含有该基因的细胞。参考答案1、一个有效的载体应该具备哪些方法的特点？在宿主细胞内能够进行自我复制，具备复制原点。有合适的限制性内切酶位点，每种位点最好有且只有1个，供外源DNA的插入且不影响其复制。有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验，便于筛选。有一定容量且有较高的拷贝数，易于制备。2、一个不含宿主的大肠杆菌做成感受态后，转化进入一个含有抗氨苄青霉素的载体，请设计一个实验筛选出含有载体的宿主。3、把一个外源基因插入以下载体，请设计实验获得含有该基因的细胞。