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中药红曲发酵制备研究何祺城规082108053056摘要：红曲既是中药，又是食品，是用红曲霉属真菌接种于大米上经发酵制备而成的。《中药大辞典》将红曲的主要功能定义为“活血化瘀，健脾消食，治产后恶露不尽，瘀滞腹痛，食积饱胀，赤白下痢及跌打损伤。”红曲的发酵制备实验主要使我们了解红曲的发酵过程、产物、步骤、功效、以及制备产生的各种结果与产物。关键词：红曲发酵制备步骤产物功效红曲的介绍与历史红曲是以籼米为原料，采用现代生物工程技术分离出优质的红曲霉菌经液体深层发酵精致而成，是一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂。而且本品色泽鲜艳、色调纯正、饱满、光热稳定性好，是天然绿色食品理想的着色剂。它应用范围广泛，包括食品类（肉制品、果汁、色酒、果酱、饮料、糖果、糕点、酱油、保健醋等）；药品类（药品着色剂、功能性保健品）；化妆品类。早在宋朝古籍如陶谷杂采隋、唐五代典故所写的《清异录》上就提到“以红曲煮肉”；胡佰的《苕溪渔隐丛话》记载：“江南人家造红酒，色味两绝。”；李之仪的《姑溪居士集》中“红糟荀”的描述，均阐明了红曲可以用来调味、著色、酿酒的食用价值。元朝以后，红曲的使用更普遍，它的药用价值逐步体现出来，许多药典和调理食物的书上均有记载。如元朝吴瑞所著的《日用本草》中叙之：“红曲酿酒，破血行药势”；约在同时代的饮膳太医忽思慧在《饮膳正要》中则说，红曲“健脾、益气、温中”。其后的药书如《本草衍义补遗》、《本草备要》及《医林纂要》等均有红曲药效之记载。明朝李时珍的《本草纲目》上也记载“红曲主治消食活血，健脾燥胃。治赤白痢，下水壳。酿酒破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤损，治女人血气痛及产后恶血不尽”。台湾民间还流传，红曲用来治小孩和老人夜尿及轻微气喘有功效极为良好。近年出版的《中药大辞典》将红曲的主要功能定义为“活血化瘀，健脾消食，治产后恶露不尽，瘀滞腹痛，食积饱胀，赤白下痢及跌打损伤。”，精确的阐释了红曲的药效。红曲功效聪明的老祖宗在唐朝便开始知道利用红曲了，本草纲目也记载红曲米的活血效能。红曲又称红曲米，古法系用粳米腌制，制造方法是选择适当红土，挖一深坑，在坑的上下周围均铺上席，然后将粳米倒于其中，压上重石，使红曲真菌寄生于粳米发酵，发酵之后，颜色转为紫红色，再收集为食品添加物。红曲在中国红了几千年，举凡医药之药材、烹饪之调味及酿酒、酱油及豆腐乳，运用层面广泛。根据一项研究发现，天然食品红曲含的“HMG-CoA还原酵素抑制剂”，让一千多位高血脂病患，胆固醇下降约11.2至32.3%，而且无副作用；研究医师表示，有25%的高血压患者不适合用药物、营养补充及运动治疗，这些患者只要搭配使用红曲清醇胶囊使用，就可有效控制胆固醇。不过在这儿要特别强调，孕妇及肝功能异常者不建议使用，而患者使用红曲清醇胶囊时，最好不要同时食用葡萄柚，以免降低功效。红曲真菌菌株产生的代谢产物，能抑制HMG-CoA还原酵素的活性，维持体内胆固醇平衡。美国加州洛杉矶分校针对1000多位高血脂病患，连续8周使用0.8至2.4公克的红曲清醇胶囊，胆固醇平均降低了26至68mg/dl，下降率为11.2至32.3%。研究人员用正常人使用的40倍以上及125倍剂量投入动物身上3个月，没有出现副作用。目前部分高血脂患者停药后，却因体质或遗传因素，血中胆固醇又再升高，周而复始，反而对身体产生不良影响；而高血脂患者中，有25%刚好介于不须吃药控制，但利用运动及营养补充又没又效果，这时使用红曲清醇胶囊，就可达到控制胆固醇目的，尤其是低密度胆固醇，尚能改善血管内皮细胞功能、血液凝结功能、抑制血管感染发炎功能及保护心肌功能。红曲发酵原料籼米系用籼型非糯性稻谷制成的米称为籼米。米粒粒形呈细长或长圆形，长者长度在7毫米以上，蒸煮后出饭率高，粘性较小，米质较脆，加工时易破碎，横断面呈扁圆形，颜色白色透明的较多，也有半透明和不透明的。根据稻谷收获季节，分为早籼米和晚籼米。早籼米米粒宽厚而较短，呈粉白色，腹白大，粉质多，质地脆弱易碎，粘性小于晚籼米，质量较差。晚籼米米粒细长而稍扁平，组织细密，一般是透明或半透明，腹白较小，硬质粒多，油性较大，质量较好。红曲代谢产物与功效一、红曲霉产生的酶葡萄糖淀粉酶是红曲霉产生的酶类中生产最早、研究最多的一种。某些红曲霉产生的糖化酶具有很高的活性。红曲霉产生的蛋白酶也有报道。Nishikawa等的研究表明，红曲霉产生的蛋白酶有多种类型。在他们研究的36个菌株中，有8株6种产酸性蛋白酶；24株9种产碱性蛋白酶；还有同时产两种以上蛋白酶的菌株。Masaaki等详细研究了用于日本红腐乳生产中的红曲霉产生的酸性蛋白酶：此酶在pH3.0时活力最高，最适反应温度550℃。有专利报道，红曲霉产生的酸性羧肽酶，可以用来分解蛋白水解物中的苦味肽。二、红曲色素红曲霉发酵产生的红曲色素是迄今为止惟一由微生物代谢生成的天然色素。在红曲霉的代谢物中，红曲色素是研究最为广泛和深入的。传统的红曲色素生产都是采用固态发酵。近十几年液态发酵也由研究进入了应用阶段。对色素的研究重点有以下几个方面：提高色素产量（色价）；改善色素在水中的溶解性及对日光的稳定性。水溶性色素由于用途广泛受到青睐，所以将水不溶性色素改性为水溶性色素的研究专利很多。一般认为，蛋白质、肽、氨基酸尤其是谷氨酸在改性中起主要作用。红曲色素的一个最大缺点就是对日光不稳定，在日光下易褪色。有研究人员针对这两点不足，设计了含有谷氨酸的半合成培养基，这样得到的红色素既有很好的水溶性，又有较强的抗日光作用。也有报道将红曲红色素与牛黄酸反应生成新的红色染料。三、红曲中的药理活性成分红曲的药用价值在我国的古籍中早有记载，但对于其中起作用的活性成分却没有进行过详细研究。最早从红曲霉中发现胆固醇合成抑制剂MonacolimK的是日本人远藤章（Endo）。他的关于MonacolinK的首次报道发表在《TheJournalofAntibiotics》1979年8月刊上。从这篇不长的研究报告中，可以得到不少的信息：实验用的菌株是他们从一种泰国食品中分离出来的；采用液态发酵的方法，5升发酵液最终得到87mg的MonacolinK结晶。文章还给出了MonacolinK的性质及降血脂的实验结果。以后又相继发现十几种结构类似物（统称为Monacolins）。从研究资料可以看出，红曲霉中的不少种都可以产生此类物质，因此也有人认为这是Monascus属的共同产物，只要条件适合都可以产生。从检索文献的结果来看，我国对MonacolinK的所有研究都在这之后。最早的研究报道是在1991年。最早的专利是1993年申请的。到目前为止，国内相关研究报道大约有百篇，专利十余项。MonacolinK能减少胆固醇的合成，达到降血脂的目的。研究还表明，MonacolinK及其衍生物如碱金属盐类等，还具有抗肿瘤、治疗动脉硬化、糖尿病等作用。迁启介等研究表明，红曲中含有降压成分，该物质为耐高压、水溶性组分，推测可能是γ－氨基丁酸或某种肽。虽然功能组分还不十分明确但可以得出如下结论：红曲具有综合预防循环系统疾病的功效。MonacolinK又称为Lovastatin（洛伐它汀），它汀类药物本来是作为治疗高脂血症的，在2000年美国科学家又发现它具有预防骨质疏松的作用，并且它与一般的单纯补钙不同，它能防止钙流失，因此能从根本上解决问题。我国已经有人在2000年底申请了将红曲用于预防骨质疏松的专利。它汀类药物具有良好的降脂作用，但是它也对肝脏有损害的副作用。然而红曲霉固态发酵的完全产物——红曲，却很少有它汀类药物的副作用。它汀类药物对肝脏有损害的原因是因为，它们在抑制胆固醇合成的同时也抑制了辅酶Q的生成，而辅酶Q对肝脏有保护作用。而在红曲中不仅有Monacoilns，还同时存在辅酶Q，所以当用红曲的全部发酵物入药就没有它汀类药物的副作用。天然物质的复合作用当显一斑。四、红曲中的抗生物质古籍中对红曲的防腐作用就有记载。现代研究也表明红曲具有抗菌活性。但是对于起作用的确切成分还无定论。香港的Wang等在上世纪80年代初将具有抗菌活性的组分命名为MonascidinA。Nozaki等报告从M.anka的培养液中分离出能显著抑制B.subtilli和E.coil的组分，命名为ankalactone，该物质无色。法国人Blanc从红曲霉的发酵液中分离出桔霉素（Citrinin）。他从多方面对Citrinin和MonascidinA进行比较，最后确定，MonascidinA就是Citrinin。Blanc因此对Citrinin在红曲霉中的代谢进行了一系列研究。需要说明的是，以上国外研究的结果都来自于液态发酵。五、红曲霉产生的其他代谢产物捷克的Juzlova等对M.purpureus产生的长链脂肪酸进行了分析，检出从C14～C24共39种脂肪酸。她还对红曲霉固态及液态发酵物中的挥发性产物进行了分析，共检出80多种挥发性物质。其中不但有我们预料之中的醇、醛、酮等，也有很多构成植物香气的成分，如萜烯、苎烯、石竹烯、香柠檬烯、杜松烯、肉豆蔻酸等。最近，又有来自美国的对含有0.4%Monacolins的功能红曲中其他组分的分析报道，在这个样品中检出的脂肪酸占2.84%，其中不饱和脂肪酸占1.43%。有油酸（0.62）、亚油酸（0.74）、亚麻酸（0.36），还有少量的花生四烯酸（0.09）。他们还检测出多种微量元素。红曲霉产生的麦角固醇并且将麦角固醇的量与红曲霉生长之间建立了数学关系。以此来表征固态发酵中红曲霉的生长情况。利用红曲霉生产辅酶Q的方法以及利用红曲霉使脂肪酸β－氧化生成与食品风味有关的甲基酮等都有专利报道。利用红曲霉无色素突变株生产L－苹果酸也有报道。红曲霉的发酵产物中还有许多成分不明确但有功效的物质。如一种可用于食品添加剂的抗氧化物质，这种物质还可以用于肝脏缺陷的治疗剂。还有人用红曲霉好氧发酵处理含有淀粉和其他营养物质的废水减少BOD含量。日本有人用Shochu废液培养红曲霉生产调味品。红曲霉还可以生产喂养鸡、鱼的发酵饲料。从红曲霉的发酵产物中可以提取到有清洁皮肤作用的物质。从以上综述可以看出，随着对红曲霉研究的深入，红曲霉产生的代谢物正愈来愈多地被发现。这也意味着红曲的应用将会越来越广泛。实验过程1.培养基（1）种子斜面培养基麦芽汁12-14°BX琼脂1.8%-2.0%pH5.0（2）平板分离培养基麦芽汁改进培养基：麦芽汁12-14°BX青霉素、链霉素30单位/毫升去氧胆酸钠0.1%琼脂1.8%-2.0%pH4.0（3）液体种子培养基（%）葡萄糖7蛋白胨7.5豆粉0.5MgSO4·7H2O0.1NaNO30.2pH6.0（4）酵母液体发酵培养基（%）甘油7葡萄糖3牛肉膏3蛋白胨0.8NaNO30.2MgSO4·7H2O0.1pH6.0（5）固体培养基米饭培养基2、实验流程（1）中药红曲制备斜面菌种→液体种子扩大培养→液体种子灭菌→培养→质量控制→烘干→中药红曲大米→浸泡→沥干→蒸煮→米饭实验分析与结论实验过程中试管内部发酵的红曲霉菌种生长较好，菌丝体分支较多，红色明显，隔阂较多，菌丝分支尖端生长的孢子较多。由试管转移到米饭培养后如图上，呈现明显红棕色，有少量为发酵完全的为红色，固定化红曲霉细胞发酵的最佳条件：接种量5．3％、初始pH值为5．9、500mL三角瓶的装液量151mL，经过96h发酵，色价可达到60U／mL左右，并且固定化红曲霉细胞发酵性能稳定。可能为接种量和液体之间的比例不足导致了，部分发酵未完全，也可能是因为时间的问题，发酵结果产生了不稳定通过对红曲霉固态发酵生产洛伐他汀发酵过程的观察，对发酵过程中菌体生长、洛伐他汀的积累、物料含水量及重量等性质的变化有了初步的认识，得出了发酵周期为１２ｄ，影响固态发酵的两个关键参数的最适值：物料厚度为４．５ｃｍ，初始含水量５０％。发现固态发酵较液体发酵有明显优势，在我们的实验条件下固态发酵洛伐他汀的产率为液体发酵的２０倍以上，并且操作简单，流程周期较长，细菌生长速度缓慢。选择乙醇为浸取洛伐他汀的初始溶剂，并确定了其最适浓度为７０％。实验名