第十章 免疫学检测技术

王晓杜浙江农林大学第十章免疫学检测技术利用免疫学原理建立的检测技术，主要应用于对多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。第一节抗原或抗体的检测抗原-抗体直接反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。抗原-抗体反应的特点1.抗原-抗体的结合是特异性结合2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合3.抗原抗体反应可分为两个阶段特异性结合阶段可见的反应阶段4.抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，于两者的分子比例密切相关抗原抗体比例对反应现象的影响抗原-抗体反应受多种因素影响•1电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓度的电解质。•2温度：一般常使用反应在37度水浴或孵育箱中进行。•3.酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度为PH6~8。抗原抗体的检测方法•凝集反应•沉淀反应•补体溶血反应和补体结合反应•中和反应•用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应凝集反应(Agglutination)细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集现象，称为凝聚反应。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。血球凝集沉淀反应（Precipitation)血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。单向免疫扩散(SingleImmunodiffusion)•是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗体的凝胶沉淀环双向免疫扩散（DoubleImmunodiffusion)•是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性、组成和两种抗原相关性分析的检测。免疫电泳（Immunoelectrophoresis)•是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。火箭电泳（RocketElectrophoresis)火箭电泳，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。火箭电泳示意图补体结合反应（ComplementFixation,CFT)敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。免疫标记技术用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。免疫荧光显微技术(ImmunofluorescenceTechnique)用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC)与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。•包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。•直接荧光法将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。•间接荧光法（indirectimmunofluorescenceassay，IFA）用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。间接免疫荧光法示意图补体结合免疫荧光法此法是在间接法的第一步抗原—抗体反应时加入补体，使之与抗原——抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。免疫荧光显微技术流式细胞术（FlowCytometry,FCM)FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。流式细胞仪工作原理酶免疫测定(EnzymeImmunoassay,EIA)用酶（常用的有辣根过氧化物酶，HRP和碱性磷酸酶，AP)标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法BAS-ELISA等。ELISA检测抗体放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性放射免疫测定法(RIA)示意图RIA法原理及标准曲线7550301001101001000未标记抗原浓度（ng/ml)结合/未结合的放射活性（%）免疫印迹法(Immunoblotting)将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒如HIV的抗体或抗原。免疫印迹法示意图二淋巴细胞的测定检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。(1)抗凝静脉血(2)加等量NS(4)密度梯度离心血浆分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓慢加于分离液上一）淋巴细胞类型和数目的测定1、花结试验：E花结试验可用于检测T细胞数目。EA花结试验可用于检测B细胞数目。2、免疫荧光法：常采用间接免疫荧光法。3、流式细胞术：借助流式细胞仪（FCM)。花结试验示意图T细胞功能测定体外法：T细胞增殖试验形态学检查3H-TdR掺入法MTT法体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。OT-PPD(结核菌素试验)皮试SD-SK(链球菌DNA酶-链激酶)皮试培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时细胞毒试验（51Cr释放法）示意图酶联免疫斑点法（Enzyme-LinkedImmunospot,ELISPOT)在ELISA的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。CK抗体包被的反应板CK抗原包被的反应板加入淋巴细胞加入酶标记二抗加入底物检测抗原特异性B细胞加入底物T细胞产生CK的检测加入淋巴细胞加入酶标的CK抗体MTT(四甲基偶氮唑盐）法原理：在细胞培养终止前数小时加入MTT，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTT产生蓝色甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。细胞毒试验•CTL介导的细胞毒试验：常采用51Cr释放法•NK细胞的细胞毒试验：常用的靶细胞为K562细胞