设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案

设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用每种技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？PPT制作：颜佩妮PPT演讲：朱泉剑资料收集：吴倩艳、宋琴琴目录碱性磷酸酶的概念碱性磷酸酶的提取、分离、纯化碱性磷酸酶的纯化程度鉴定碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术的原因碱性磷酸酶的概念碱性磷酸酶是动物和微生物界普遍存在的一种含锌酶，它在物质代谢中起着重要的作用。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯进行水解，产生无机磷和相应的醇、酚或精，但却不能水解磷酸H酿类碱性磷酸酶广泛分布于人体各内脏器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。实验原理1.动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。2.在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。3.有机溶剂分步沉淀法纯化有机沉淀法•实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性磷酸酶.AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。常用的有机溶剂•乙醇:沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析.•丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广.•正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中.称取新鲜兔肝（可使用猪肝）2g。分离纯化AKP步骤将1g新鲜兔肝置于70℃冰箱进行预先冷冻处理后取出，置于玻璃匀浆器内。加入0.01mol/L醋酸镁、0.01mol/L醋酸钠混合溶液3mL，充分研磨至糊状。将匀浆液倒入刻度离心管中，使用4ml上述混合缓冲液冲洗研磨器具，将冲洗液一并转入离心管。离心管一定要置于冰块保护下，以后各个步骤也要注意保持低温。加1mL正丁醇于匀浆原液中，用玻棒充分搅匀，然后放置冰浴中20min。用滤纸过滤，滤液置于另一支刻度离心管中。过滤，滤液也要冰块保护滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。立即混匀后使用台式低速离心机离心5min(2000r/min)，弃上清液。向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L醋酸镁溶液，充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％，混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。向沉淀中加入4．0m10.0lmol/L醋酸镁一0.01mol/L酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去沉淀AKP纯化程度鉴定•纯化程度用酶的比活性反应。•酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。碱性磷酸酶的活性测定磷酸笨二钠法•在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。•测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。AKP的蛋白含量测定BCA法则•蛋白质+Cu2＋•利用分光光度计测吸光度•设计标准曲线计算蛋白质含量碱性Cu＋BCA试剂紫色化合物•1、AKP比活性：•AKP比活性（U/mg）=•2、纯化倍数•纯化倍数=每ml制剂中AKP活性单位数（U）每ml制剂中蛋白质含量（mg）溶液A制剂AKP比活性（U/mg）每一制剂AKP比活性（U/mg）碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术的原因•通过低温预冷处理有机溶剂分级提取兔肝碱性磷酸酶，结合SDSPAGE法检测纯化结果。对酶的比活力测定中蛋白定量经过对Bradford法和FolinLowry法进行比较发现FolinLowry法在本样品体系中灵敏度高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含量测定。•盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。福林-酚试剂显色法用来测定蛋白质浓度。离子交换层析法的原理•阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有亲水性。•由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。