SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量

蛋白质相对分子质量的测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法【实验目的】•理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。•掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本操作•学会绘制标准曲线。【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成，是一种具有交叉网状结构的凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。本实验利用了聚丙烯酰胺凝胶的电泳和分子筛双重作用。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它的疏水端可以与蛋白质分子结合。绝大多数蛋白质与SDS结合的质量比为1.4:1，使蛋白质带上密度相同的负电荷，其电荷强度远远强于蛋白质原有的电荷，这就掩盖因为蛋白质种类不同而造成的电荷差异，使电泳的迁移率仅与蛋白质的分子量有关。因此，我们可以测定标准蛋白质的迁移率，通过标准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质量。本实验就是依据这个原理进行测定的。【实验器材】DYCZ-24D型垂直板电泳仪移液管若干100mL烧杯微量进样器细长头吸管【试剂配制】1.分离胶和浓缩胶试剂名称Acr/gBis/g1mol/L盐酸/mL三甲基氨基甲烷（Tris）/g定容体积/mL分离胶贮存液300.8100（棕色瓶，冰箱中保存）分离胶缓冲液4836.3100浓缩胶贮存液100.5100（棕色瓶，冰箱中保存）浓缩胶缓冲液485.98100【试剂配制】2.电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3）：取Tris6.0g，甘氨酸28.8g，SDS1.0g，用去离子水溶解后定容至1L。3.样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白质）：取SDS0.1g，巯基乙醇0.1mL，甘油1.0mL，溴酚蓝28.8g，0.2mol/L磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸馏水至10mL。4.染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加入454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。5.脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇6.10%过硫酸钠、10%SDS、1%四甲基乙二胺（TEMED）【试剂配制】【实验材料及预处理】选用5种相对分子质量已知的蛋白质作为标准蛋白质：溶菌酶（Mr=14300）胰凝乳蛋白酶原（Mr=25000）胃蛋白酶（Mr=35000）卵清蛋白（Mr=43000）血清白蛋白（Mr=67000）可以配成单一标准蛋白质溶液，也可配制成混合蛋白质标准溶液。将标准蛋白质和待测蛋白质用样品溶解液溶解，使浓度为0.5mg/mL，沸水浴加热3min，冷却至室温备用。对以上标准蛋白质相对迁移率的测定，以相对迁移率的对数对标准蛋白质的相对分子质量作图，可得标准曲线，由标准曲线求出待测蛋白质的相对分子质量。【实验步骤及操作方法】1.安装垂直板电泳槽将密封胶条放在平直玻璃板上，将凹形玻璃板与平直玻璃板重叠。用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。用蒸馏水检漏【实验步骤及操作方法】2.凝胶制备（1）分离胶分离胶按下表加入试剂试剂体积操作分离胶贮存液5.0分离胶缓冲液2.510%SDS0.2去离子水10.21%TEMED2.0混匀10%过硫酸铵0.1置于磁力搅拌器中搅拌2min混合后的分离胶溶液，用细长头吸管加入玻璃板缝隙内，加胶高度距离样品模板梳齿下端约1cm，用吸管在凝胶表面轻轻加一层蒸馏水（约3-4cm），使凝胶隔绝空气，并保持胶面平整。等待分离胶凝固后，将水倒出并用滤纸吸干剩余的水。（2）.浓缩胶浓缩胶按下表加入试剂试剂体积操作浓缩胶贮存液3.00浓缩胶缓冲液1.251%TEMED2.00去离子水4.6010%过硫酸铵0.05置于磁力搅拌器中搅拌2min用细长头习惯将分离胶溶液加入分离胶上方，距离段玻璃板上沿0.5cm处，然后轻轻加上模板梳，等待浓缩胶凝固后，小心取出模板梳，用手夹住两块玻璃板，取出胶室，去掉密封胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将胶室放入电泳槽，然后加入电泳缓冲液，内槽加到凹口以上，外槽加到具平直玻璃板上沿3mm处。3.电泳用微量进样器取10-15μL样品，小心加入到凝胶凹槽内，待所有样品全部加完之后，打开电源开始电泳。电泳开始时，将电流调至10mA，待样品到达分离胶与浓缩胶交界时，将电流调整至20-30mA，当溴酚蓝迁移到分离胶底部时，可以关闭电源停止电泳。4.染色与脱色取出玻璃胶室，轻轻撬开玻璃板，取出凝胶。将凝胶转移到装有染色液的培养皿中，染色1h左右，然后取出，用蒸馏水漂洗凝胶，转入脱色液中脱色，同时放在摇床上震荡，期间更换3-4次脱色液，直到可以清晰的分辨蛋白质条带。5.结果处理）溴酚蓝移动距离（）样品移动距离（（相对迁移率）mmmmfR以标准蛋白质的相对迁移率的对数对相对分子质量作图，得到标准曲线，根据标准曲线求出待测蛋白质的相对分子质量【注意事项】•每次实验必须绘制标准曲线，不得使用上一次的标准曲线•处理好的蛋白质样品液如果长期存放，使用前应先在沸水浴中加热1min以除去亚稳态聚合。•若样品为溶液，则需要降样品溶解液浓度提高一倍，再与样品等体积混合。•在向玻璃缝隙中注胶时，应保持在一点加入，而加水时，要不断移动吸管。•进样时，要注意不要太快或将凹槽加的太满，防止样品溢出，对其他凹槽造成交叉污染。•Acr和Bis均为神经毒剂，甲醇也是剧毒物质，使用应注意安全【对实验的思考】•在配制样品溶解液时，加入巯基乙醇是为了将蛋白质中的二硫键破坏，使蛋白质更容易与SDS结合。•此实验时间较长，主要是由于染色脱色事件较长。由于SDS可以吸附考马斯亮蓝，染色前可用脱色液浸泡凝胶，洗去SDS，可缩短染色及脱色时间。