第六章 血液代用品

第六章血液代用品Contents概论1血红蛋白的结构和功能2血红蛋白的化学修饰4血红蛋白的制备工艺53血液代用品的类型主要内容1概论血液的功能常规输血的忧患血液代用品具有的特点血液的功能运输氧气、二氧化碳和营养物质及代谢产物，可以调节组织的水分、酸碱度、渗透压和温度，还可以吞噬细菌（白细胞和巨噬细胞），产生抗体（淋巴细胞）等血液血细胞红细胞白细胞血小板血浆(细胞间质)水血浆蛋白、糖、维生素、激素、代谢产物及无机盐等血细胞常规输血的忧患输血时必须血型相配，延误治疗而造成死亡；血液污染严重，威胁输血安全；健康供血人群不足，血液严重短缺；血液的保存期短。血液代用品具有的特点无菌、无病毒、无毒性、无热源、对输入体无免疫原性适合各种血型与人血液所有组分具有相容性，在最大限度上代替人血的生理功能（具备运输氧、二氧化碳的能力，提供缓冲和自由基淬灭能力，可起到血浆扩容作用并维持胶体渗透压)在血管内有较长的保留时间，代谢产物无毒并能经过正常的渠道排出储存时间长，而所需的条件不高。血液代用品指具有携带氧气和扩容功能的溶液。2血红蛋白的结构和功能血红蛋白的结构和功能；影响血红蛋白氧亲和力的因素。Hb的组成与结构Hb4条珠蛋白链：α141×2；β146×2（共574个AA）4分子血红素每条多肽链结合一个血红素分子构成一个Hb单位∴Hb是四聚体，在红细胞中占干重的95％Hb的组成血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的功能血红蛋白是一种双向呼吸载体，主要负责运输氧和二氧化碳；血红蛋白和氧的结合与解离主要取决于氧的分压和血液的pH。血红蛋白氧饱和分数和氧分压的关系呈S形曲线；曲线说明血红蛋白与氧的结合随氧分压的增高而加快，释放氧则随着氧分压的降低而加快。这样血红蛋白可在较窄的氧分压范围内完成输氧任务，使机体内氧水平不致有较大的起伏。影响血红蛋白对氧亲和力的因素P50；影响血红蛋白氧亲和力因素包括红细胞内的H+、CO2，氧,2,3-DPG以及其他阴离子的浓度等；波尔效应；2,3-DPG的影响。3血液代用品的类型无载氧功能的血管扩容剂（第一代红细胞代用）；全氟碳化合物、化学修饰血红蛋白及基因重组血红蛋白（第二代血红蛋白代用品）；模拟天然红细胞膜和红细胞内的生理环境，用仿生高分子材料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”。（第三代血液代用品）全氟碳化合物全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)国外很早就有人开始血液代用品的研究。1966年，由美国Cincinnati大学的Clark首创并做动物实验，发现小鼠在含有PFC的饱和氧中能正常生存。1978年Naito等首次将第一代氟碳化合物（FluosolDA)用于临床实验。PFC的优点是可以直接用化学方法合成，价格低廉，而且不受生物来源的影响，避免因异体输血而造成的交叉感染。全氟碳化合物—定义及性质PFC是将碳氧化合物中的氢原子全部用氟原子取代而产生的一类环状或直链状结构的有机化合物。PFC随温度变化而可成固、液、气态，常温下PFC为液态，但不溶于水，需要经过乳化变为可溶性乳剂。PFC氧离曲线与氧分压呈直线相关，不受pH值影响，其溶解氧的能力约为血液的2倍、水的20倍全氟碳化合物全氟萘烷全氟碳化合物优点：生产不依赖于过期的人血或者其他生物来源的血液，能够大批量生产，而且纯度可以很好的控制；对于不愿意接受别人血液或者血液替代品的宗教信仰者。可使用这种化学合成物；缺点：使用时必须呼吸70%-100%的氧；有效时间短；存放需要合适的温度和条件；流感样症状。血红蛋白类血液代用品天然血红蛋白；血红蛋白类血液代用品；1）血红蛋白的制备；2）血红蛋白的化学修饰。天然血红蛋白比全氟碳化合物更符合人体生理需要，来源广泛；20世纪30年代，Amberson将制备的血红蛋白输送给动物进行研究，结果表明这种血红蛋白能有效地输送氧气，但是对肾脏的毒性大。其原因主要是溶血质中存在少量膜基质及杂蛋白；无基质血红蛋白（stromafreehemoglobin,SFH)。1）失去DPG的变构调解作用（放氧和载氧降低）；2）易解聚为αβ二聚体，氧传递能力下降，容易从肾脏滤出，形成血尿，其代谢产物还会在肾脏小管腔内产生毒性效应。3）在体内保留时间短。血红蛋白类血液代用品血红蛋白的制备样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：蛋白质提取和分离步骤操作过程可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作：1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。初次离心后的结果次洗涤后的结果(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。②原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。透析过程动画演示利用透析袋透析凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装配好的凝胶柱④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白血红蛋白类血液代用品血红蛋白的化学修饰目的：稳定血红蛋白4聚体结构，增加蛋白相对分子量，以达到降低毒性的作用。原理：表面有许多可修饰的功能基团类型：分子内交联血红蛋白、多聚血红蛋白、共轭血红蛋白、脂质体包封血红蛋白；基因重组血红蛋白分子内交联血红蛋白血红蛋白的化学修饰血红蛋白肽链间的交联，降低氧的亲和力。试剂：含有负电基团并能结合在血红蛋白中心腔位置，如双阿司匹林类化合物（3，5-二溴水杨基双延胡索酸酯），吡哆醛类化合物。产品：美国Baxter公司的DCLHb、加拿大Hemosol公司的HemolinkDCLHb血红蛋白的化学修饰diaspirincross-linkedhemoglobin。用3，5-二溴水杨基双延胡索酸酯对脱氧的无基质血红蛋白进行分子内修饰生成α链间交联产物。相对分子量65000。。临床：患者出现皮肤黄染、无症状血尿、肠梗阻发生率显著提高，三期临床死亡率增加，于1999年终止临床试验。Hemolink血红蛋白的化学修饰O-棉籽糖交联血红蛋白，由各种相对分子量的聚合、非聚合成分组成，含交联Hb大于95%。临床：三期已在美国、英国和加拿大开展。不良反应是血压升高，但在48-72小时内恢复对肝肾功能无影响。多聚血红蛋白血红蛋白的化学修饰分子间修饰主要是形成分子聚合物，从而防止血红蛋白四聚体的快速解离，延长在血管中的停留时间。交联剂主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。与血红蛋白反应时无特异的结合位点，属于多位点修饰，形成相对分子量不等的交联聚合体，从而减少溶液中分子数目，溶液渗透压和黏度也随之降低。产品：美国Biopure公司的Hemopure和NorthfieldLaboratories公司生产的Polyheme共轭血红蛋白血红蛋白的化学修饰血红蛋白与天然或者合成的可溶性高分子反应，形成共轭结合物，可以大大增加Hb的稳定性，有效地防止四聚体解离；同时包裹在Hb周围的高分子链覆盖了抗原位点，起到了降低免疫原性，提高存留时间；而且，分子稳定性好，能在循环中维持较高氧含量，并降低网状内皮系统的吞噬，较少可能的过敏和免疫反应。可使失血30-50%的狗在两周内无死亡现象，体重、食物摄入量均正常，无明显毒性反应，尿液分析和血液动力学指标也无明显变化。化学修饰存在的问题血红蛋白的化学修饰产品是非均一性混合物；病原微生物尚未解决；大分子的聚合体使某些蛋白溶液引起许多病症；终产物不稳定性，导致交联Hb间的重新排列；重现率低。脂质体包封血红蛋白血红蛋白的化学修饰模拟天然红细胞膜和红细胞内的生理环境，用仿生高分子材料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”优点：1）血红蛋白不直接暴露于内环境；2）可将红细胞所属的各种酶类包括在人工细胞内，避免四聚体的解离而产生的肾毒性；3）脂质体不与血型抗体反应，延长其循环时间；4）血红蛋白未经过化学修饰，保证其正常生理功能；5）包裹天然红细胞内的高铁血红蛋白还原系统；6）包封入DPG，可降低Hb氧结合力，增加传递氧的能力。脂质体包封血红蛋白血红蛋白的化学修饰制备的两个基本条件：1）制备过程中确保极易被氧化的血红蛋白不被氧化；2）脂质体包封血红蛋