总RNA的提取-电泳鉴定及RT-PCR

实验二、RNA提取及RT-PCR实验内容1、小鼠肝脏组织总RNA的提取2、RNA的琼脂糖凝胶电泳3、以RNA为模板进行RT-PCR4、PCR产物的电泳及回收实验一.提取小鼠肝脏组织的RNA一、真核细胞的总RNA1、mRNA:1-5%5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进蛋白质合成。3`poly(A)尾巴结构20--200个A.翻译所必需。起始密码：AUG终止密码：UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt小亚基40S:18S=1874nt二、RNA提取的注意事项RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase活性：RNase抑制剂。RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。将1mLTrizol试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mLTrizol试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。4)室温孵育10min。三、RNA提取的实验操作播放有声课件1:RNA提取方法及注意事项1、异硫氰酸胍法：GuSCN是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总RNA，简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。RNA提取的几种方法室温孵育10min介绍RNase抑制剂1、DEPC(二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材。灭活条件：高压。在Tris溶液中半衰期为1.25min。试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制,高压)储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4C，或液氮中。2、肝素：使用浓度：0.1—10mg/ml效果:37C时，可抑制95%的RNase活力。如果与DEPC联合应用，具有极强的抑制效果。5)加入200l氯仿，震荡混匀20-30s，室温放置5min（此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）。6)10000rpm，离心5minRNA(清澈透明)DNAProtein7)将清澈透明的上层水相转移至另一离心管中。有声课件2:RNA干燥及溶解技巧8)沉淀RNA：加0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10min。10,000rpm，4C，离心10min．弃上清。９)加1ml75%乙醇洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)10)7500rpm，4C离心1min，弃上清．再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。11)室温干燥3－5min（根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）注意事项：RNA:避免放在37C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。RNApellet：透明胶样干燥后应该无色透明12）RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O13.5l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。13)吸出4.5l溶液放到冰上备用(将用于电泳).14)剩余9l溶液,放到冰上备用（将用于RT－PCR）.注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。避免气泡的方法：用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯为止。实验二.RNA的琼脂糖凝胶电泳基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解RNA的琼脂糖凝胶电泳RNA样品：4.5l上样缓冲液：1l混匀后，5.5l直接电泳上样（100伏，10－30分钟）上样前预电泳5min。注意:电泳槽的清洁！所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。琼脂糖凝胶要新鲜配制！紫外透射仪观察电泳结果RNA的电泳上样：RNA电泳结果rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。分析本次实验结果：28S、18S和5S的比例。RNA电泳结果分析实验三：逆转录反应及PCR（RT-PCR)逆转录酶：存在于逆转录病毒体内。常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC。以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNA－cDNA。RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。逆转录反应原理AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC,annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC,RTasemRNAmRNAcDNA10min1-2h逆转录有声课件3:RT的原理和注意事项总RNA9lOligodT(0.05g/ml)1l(终：2.5ng/ml)轻弹管底混合，置65℃水浴10min，立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。第一步：打开RNA链之间的二级结构，使OligodT特异性地结合到PolyA尾。5RT-buffer4lRNasin(RNA酶抑制剂，40U/ml)1ldNTPs(10mmol/L)4lAMV（逆转录酶）1l轻弹管底混合。置42oC水浴1h。第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂第三步：将上述反应移至68oC水浴10min以灭活RTase，并冰浴，保存备用午休—PCR反应体系的建立—PCR反应的进行—PCR产物的电泳—结果观察与分析—PCR产物回收实验操作内容有声课件（1）：PCR的基本原理及反应体系的组成PCR反应动画目的基因片断的体外扩增（2）：PCR反应条件的确定及PCR常见问题的解决方案1）模板DNA(上次课逆转录的cDNA）4l2）加入下列试剂,，顺序可以改变10XPCRbuffer(含MgCl2)5ldNTPs(10mM)1l3’引物(10mol/L)1l5’引物(10mol/L)1l3）加去离子水，补足50l最终反应体系4）TaqDNA聚合酶(2U/l)1l实验操作一、建立PCR反应体系3.轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下；4.将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。1.取1支200l微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中，用Marker笔在管的侧面标记；2.依次加入下列试剂：注意：（1）PCR相关试剂均放在每排实验台上方中间位置处的蓝色圆盒中（2）加样的体积要准确，1l的体积不应该超过白色枪头的第一个格。实验操作二、PCR反应的进行1、将样品放入PCR仪中2.PCR反应条件94℃30SDNA变性(Denaturation)55℃30S退火(Annealing)72℃45S延伸(Extension)上述温度变化进行30个循环(cycles)。72℃10min(Furtherextension)。3.将同学们分成三组，分别观察PCR的温度循环。其它同学课间休息。播放：有声课件（PCR讲解1）播放：有声课件（PCR讲解2）播放：PCR动画实验操作三、PCR产物的电泳1.教师指导学生将琼脂糖凝胶（1%）放入胶床上。2.样品制备：在50lPCR产物中，加入6ul上样液，混匀。（上样液：10×Loadingbuffer或6×Loadingbuffer）3.上样：将上述样品加入凝胶加样孔中。注意：DNAMarker。4.电泳：100伏，30分钟。操作四、PCR产物的电泳结果观察及分析GAPDHgene片段(746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker12（2）此PCR结果存在什么问题？原因？你拟采用哪些措施解决上述问题？？？（1）观察：蓝色箭头指示的是何种DNA？GAPDHgene片段(746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker12挤胶法回收PCR产物：（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入封口膜中；（2）将切下来的胶块，标记好姓名，-20℃冰箱中。（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。PCR电泳结果实验操作五、PCR产物的回收思考题：1.PCR反应的第几个循环开始出现符合预期长度的目的DNA片段？请画图说明。2.用TaqDNA聚合酶进行PCR时，获得的PCR产物的末端都有哪些情形？T-A连接的原理是什么？影响连接效率的因素有哪些？实验结束后整理实验台,值日生值日!