第三章 酶的生物合成

第三章酶的生物合成与发酵生产酶的生物合成与发酵生产定义酶的生物合成：即生物体内酶合成的过程酶的发酵生产：利用微生物代谢活动生产所需酶的过程目前工业上使用的酶大多数是利用微生物发酵生产的。利用微生物发酵产酶的优点微生物生长繁殖快，生活周期短，用微生物产酶几乎可以不受限制的扩大生产，满足市场需求微生物种类多，且在不同环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同底物，这为微生物酶种类的多样性提供了物质基础微生物培养基来源广泛易得、价格便宜微生物发酵产酶过程可以采用连续化、自动化控制，生产效率高，经济效益好可利用分子生物学技术选育菌种，提高酶产率利用基因工程可使动植物细胞中存在的酶用微生物细胞来生产获得工业用部分主要酶的生产菌种微生物类别菌名产生的酶用途细菌枯草杆菌淀粉酶酒精与啤酒工业、洗涤剂、糊精加工、纺织品脱浆等蛋白酶生丝脱胶、皮革脱毛、胶卷回收、酱油酿造大肠杆菌L-天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸：治疗白血病青霉素酰化酶制备新青霉素的母核6-氨基青霉素烷酸异型乳酸杆菌葡萄糖异构酶由葡萄糖制果糖短小芽孢杆菌碱性蛋白酶皮革脱毛产气气杆菌异淀粉酶分解淀粉的α-1,6-糖苷键酵母解脂假丝酵母脂肪酶绢丝原料脱脂、洗涤剂、医药、乳品增香啤酒酵母、假丝酵母转化酶制造转化糖霉菌点青酶葡萄糖氧化酶食品加工中食品去氧、除葡萄糖，作试剂测定葡萄糖放线菌转化微白色放线菌蛋白酶皮革脱毛酶发酵生产菌种要求产酶量高，具有生产应用价值易培养，既能适应大生产粗放的营养和生产条件，包括能利用廉价原料、对工艺条件要求不苛刻代谢速率高，发酵周期短产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不易感染噬菌体安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢物安全无毒，在系统发育上与病原体无关选用产胞外酶菌种，有利于酶的分离提取微生物产酶菌株的获得含菌样品采集菌种分离纯化菌种的初筛菌种的复筛最佳产酶条件初步确定微生物产酶性能的进一步提高微生物产酶菌种保存酶发酵工艺条件及控制培养基营养成分：碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶促进剂等发酵条件控制剂对产酶的影响：温度、pH值、溶解氧固定化微生物细胞发酵产酶的工艺及其控制培养基成分碳源：是构成菌体细胞的主要元素、构成酶骨架的元素之一，也是菌体生命活动所需能量的主要来源。应根据细胞对酶营养要求的不同而选择合适碳源氮源：是生物体合成各种含氮物质的组成成分，是酶制剂生产的原料无机盐：大量元素和微量元素生长因子：氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶、激素等。产酶促进剂：诱导物和表面活性剂发酵条件控制及对产酶的影响温度：影响微生物生长和合成酶、影响酶合成后的稳定性pH:影响微生物体内各种酶活性，从而导致微生物代谢途径发生变化；影响微生物形态和细胞膜通的透性，从而影响微生物对培养基中营养成分的吸收以及代谢产物的分泌；影响培养基中某些营养物质的分解或中间产物的解离，从而影响微生物对这些营养物质的利用生产中pH调控方法调节培养基初始pH值，控制合适C/N，调整生理酸性物质与生理碱性物质之比例；补料调节，即通过发酵过程中流加碳源、氮源来调节pH；添加缓冲液，维持一定pH值；如pH值变化较大，可直接流加酸或碱进行调节；通过对溶解氧的调节，来控制中间产物的氧化程度。发酵条件控制及对产酶的影响（二）溶解氧：通气量越大、氧分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。此外，培养液的性质，主要是粘度、气泡以及温度等对溶氧速率有明显的影响，可通过以上方面调节溶氧速率。溶氧量过低，会对微生物生长、繁殖和新陈代谢产生影响，从而使酶产量降低。但，过高的溶氧量对酶的发酵生产业会产生不利影响，一方面会造成浪费，另一方面高溶氧也会抑制某些酶的生物合成，因此在整个发酵过程中应根据需要控制好溶氧量。固定化微生物细胞产酶的工艺条件及其控制应注意事项需要对固定化微生物细胞进行预培养增加溶宜解氧的供给发酵温度的控制培养基组分的特殊要求：1）培养基浓度不过高，并可通过改变培养基组分来降低培养基粘度，有利于氧的溶解和传递，从而克服固定化细胞好氧发酵过程中氧溶解和传递的限制；2）培养基组分不能影响固定化细胞的结构稳定性，或影响很小固定化微生物原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制应注意事项培养基渗透压的控制控制培养基组分，防止细胞壁再生维持较高的原生质体浓度提高酶产率的方法酶生物合成的调控机制打破酶合成调节机制及提高酶产量的方法酶生物合成的调控机制酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度，细胞根据其自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节，在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中，转录水平的调控占主导地位，是酶生物合成中最重要的调节操纵子操纵子（operon）是一组功能上相关且受同一调控区控制的基因组成的遗传单位操纵子是酶合成调控的结构基础操纵子调控模型根据基因调节理论，在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因（regulatorgene）、启动基因（promotergene）、操纵基因（operatorgene）和结构基因（structuralgene）。1.结构基因与多肽链有各自的对应关系。结构基因上的遗传信息可以转录成为mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，每一个结构基因对应一条多肽链。2.操纵基因可以与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。操纵子调控模型（二）3.启动基因决定酶的合成能否开始，启动基因由两个位点组成：一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cyclicAMP，cAMP）与CAP组成的复合物（cAMP-CAP）的结合位点。CAP是指环腺苷酸受体蛋白（cAMPacceptorprotein）或分解代谢物活化剂蛋白（cataboliteactivatorprotein）。只有到达启动基因的位点时，RNA聚合酶才能结合到其在启动基因上的相应位点上，转录才有可能开始，否则酶就无法开始合成。阻遏蛋白调节基因可以产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，RNA聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法进入到结构基因的位置进行转录，因而无法将DNA上的遗传信息转录到mRNA分子上，酶的生物合成也就无法进行。只有当阻遏蛋白通过与效应物（又称辅助阻遏物）结合，改变结构而不与操纵基因结合时，RNA聚合酶才能结合到启动基因的位点上，进行转录，使结构基因所对应的酶进行生物合成。原核生物操纵子类型诱导型操纵子（inducibleoperon）：在无诱导物时，其基因不表达或表达的水平很低，只有当诱导物存在时，才能进行转录生成mRNA，进而经翻译合成酶。如乳糖操纵子阻遏型操纵子（repressibleoperon）：在无阻遏物时，基因正常表达，当有阻遏物时，转录则受到阻遏，酶不能合成。如色氨酸操纵子转录水平的调节酶生物合成的诱导作用酶生物合成的反馈阻遏作用分解代谢物阻遏作用酶根据酶生成是否与环境中所存在的该酶底物或其相关物质的关系，把酶分为：1组成酶：是细胞内固有的酶类，不管是否其底物或结构类似物存在都有一定量存在，它的合成是在相应的基因控制下进行的，如EMP途径中的酶类2诱导酶：是细胞为适应外来底物或结构类似物时而合成的一类酶，其合成明显受环境因素影响酶合成的诱导现象大肠杆菌在葡萄糖培养基上不能产生利用乳糖的酶当培养基中只有乳糖时，可产生利用乳糖的酶在培养基中添加葡萄糖后，利用乳糖的酶消失乳糖操纵子诱导酶合成的过程R：调节基因O：操纵基因S：结构基因酶生物合成的诱导作用酶合成的诱导作用：由于加入某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用诱导物：能诱导酶合成的物质，称为诱导物。被诱导合成的酶叫诱导酶诱导物一般是酶催化作用的底物、酶底物类似物或酶催化反应的产物。例如，β-半乳糖苷酶的作用底物乳糖及其底物类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导β-半乳糖苷酶的生物合成；蔗糖及蔗糖甘油单棕榈酸酯诱导蔗糖酶的生物合成等。有些酶也可由其催化反应产物诱导产生。例如，半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，它也可以作为诱导剂，诱导果胶酶的产生；纤维二糖作为纤维素酶的催化反应产物可诱导纤维素酶的生物合成等。酶合成阻遏现象大肠杆菌在无机盐和葡萄糖培养基中可检测到色氨酸合成酶，可满足自身需要；若在培养基中添加色氨酸，可发现色氨酸合成酶的活性降低，甚至消失，色氨酸不再合成；色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则，即不需要，不合成。分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用是指某些物质（主要是指容易利用的碳源）经过分解代谢产生的分解代谢物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。例如，葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成，果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成等。分解代谢物阻遏作用之所以产生，是由于某些物质（如葡萄糖等）经过分解代谢放出能量，有一部分能量储存在ATP中。ATP是由AMP和ADP通过磷酸化作用生成的。这样细胞内ATP的浓度增加，使AMP的浓度降低，存在于细胞内的cAMP就通过磷酸二酯酶的作用水解生成AMP。酶生物合成的反馈作用酶生物合成阻遏物的反馈作用又称产物阻遏作用，是指酶催化的产物或代谢物的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象，它是通过阻止编码该酶的基因的表达而进行的。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物或叫共阻遏物。被辅作用而停止合成的酶叫阻遏酶共阻遏物一般是酶催化反应的产物或是代谢途径的末端产物。例如，无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解的产物，它的过量存在，却会阻遏碱性磷酸酶的生物合成；色氨酸作为色氨酸合成途径的终产物，它的过量积累却反过来对其合成途径中的4种酶（邻氨基苯甲酸合成酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸转移酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶和色氨酸合成酶）的生物合成均起反馈阻遏作用酶生物合成阻遏作用的调节机制在没有共阻遏物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的亲和力弱，不能与操纵基因结合。所以，RNA聚合酶可以结合到其在启动基因的位点上，进行转录，而合成结构基因所对应的酶而当环境中有辅阻遏物，并达到一定浓度时，阻遏蛋白与辅阻遏物结合，使阻遏蛋白结构发生变化，从而使阻遏蛋白与操纵基因结合。RNA聚合酶就不能通过操纵基因而移动到结构基因进行转录，因而阻遏了酶的生物合成分解代谢物阻遏作用某些物质（主要指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代谢的产物阻遏某些酶（特别是参与分解代谢的酶）生物合成的现象称为分解代谢物阻遏作用，也称葡萄糖效应分解代谢物阻遏作用之所以产生，一是由于葡萄糖等的分解代谢引起ATP浓度上升，消耗胞内cAMP；二是当葡萄糖等作为唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶活性有抑制作用，降低cAMP的生成机制葡萄糖等易利用碳源经过分解代谢放出能量有一部分储存在ATP中。ATP是由AMP和ADP通过磷酸化作用生成的。这样细胞内ATP的浓度增加，使AMP的浓度降低，存在于细胞内的cAMP就通过磷酸二酯酶的作用水解生成AMP。cAMP的浓度降低，cAMP-CAP复合物减少，RNA聚合酶也就无法结合到其启动基因的相应位点上，故转录不能进行，酶的生物合成受到阻遏随着细胞的生长和新陈代谢的不断进行，ATP被消耗而浓度降低，细胞内ADP及AMP浓度增加，cAMP的生成增加，当cAMP浓度增加到一定水平时，cAMP-CAP复合物结合到启动基因的特定位点上，RNA聚合酶也随之结合到相应的位点上，酶的生物合成才可能进行（但诱导酶还同时需诱导物存在）打破酶合成调节机制限制，提高酶产量通过条件控制（包括添加诱导物和降低阻遏物浓度）提高酶产量通过基因突变和基因重组提高酶