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双波长法测定混合物中非那西汀和咖啡因的含量分光光度法利用紫外-可见吸收光谱对物质进行定性和定量分析的方法就是紫外-可见分光光度法，属于分子吸收光谱，由分子的外层电子跃迁产生，是宽带吸收光谱。物质对光吸收遵循朗伯-比尔定律，即当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比。同一种物质对不同波长光的吸光度不同，吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。对同一种物质，在一定波长时，随着其浓度的增加，吸光度A也相应增大；而且由于在λmax处吸光度A最大，在此波长下A随浓度的增大而增加。可以据此进行物质的定量分析。二、实验原理如果多组分混合物中各组分的吸收带互相重迭，只要溶液中各组分相互间不发生任何反应即没有相互作用，而且它们对入射光的吸收能符合朗伯—比尔吸收定律时，则多组分溶液的总吸光度值等于各组分的吸光度之和，即：这就是吸光度具有的加和性特征。如果混合液中的不发生任何反应的两组分的吸收带互相重迭，只要它们能符合朗伯—比尔定律，根据吸光度加和原理，对两个组分即可在两个适当波长（一般选择这两种组分的最大吸收波长）进行两次吸光度测定，然后解两个联立方程式就可计算出混合液中这两种组分的浓度。解上两式的联立方程组，可得：式中，A为吸光度；ε为摩尔吸光系数，单位L·mol-1·cm-1；c为浓度，单位mol·L-1；b为光程，单位cm；B1，B2表示不同组分；λ为波长。若待测组分的浓度不是摩尔浓度，则吸光系数就不是摩尔吸光系数，简称为比吸光系数(或吸光系数)，以k表示，其单位视浓度单位而定。a－非那西汀b－咖啡因如果组分的浓度单位为µg/mL，比色池的厚度（光程长度）单位为cm，由于A=kCbk=A/Cb故：k的单位为mL·µg-1·cm-1•式中，k为两组分分别在其最大吸收波长处的吸收系数，分别由各自的标准溶液测得其吸光度A，再由上式计算求得。非那西汀在244nm处有一吸收峰；而咖啡因在272nm处有一吸收峰。实验时，分别测定非那西汀和咖啡因混合液在244nm处和在272nm处的吸光度值A244及A272。然后利用上述关系式求算C非及C咖。在非那西汀和咖啡因的双组分混合物中，两组分的分别测定就属上面这种情况。1）仪器组成单色器、双光束方式、光电倍增管（检测器）2）工作原理图3）仪器特点（1）低杂散光，高光通量，可对高浓度的样品不进行稀释直接测定（2）应用广泛：可用于分析有机、无机化合物；DNA、酶等生化样品；光学材料的特性（3）配备了功能强大的UVProbe软件，包含光谱测定、光度测定、动力学测定和报告处理四大模块，从基本的测定到研究解析都可通过它实现。4）仪器操作规程1.打开电源开关，打开电脑及软件，进入自检界面，进入自检画面。2.单击确定开始自检，自检过程中不得打开样品室盖3.完成自检后，单击光谱扫描按钮，选择“方式”，设定波长及测量方式（Abs）4.将参比溶液放入参比池中，另一参比液放入样品池第一池内。点击自动清零键清零。5.取出样品池中参比，放入测量液，进行全波长扫描，找出最大吸收波长。6.取出测量液，将未知试样放入测量池中，测定最大吸收波长的吸光度。7.根据公式计算相应浓度。实验测量结果记录表表1标准溶液扫描时记录数据及计算表样号A（λmax咖）A（λmax非）未知样液表2未知试液测量时记录表标准试液标液浓度μg·mL-1最大吸收波长（nm）吸光度值(通过仪器测出来的)吸光系数(mL·μg-1·cm-1)(根据浓度、吸光度计算出来的)λmax非λmax咖λmax非λmax咖非那西汀C非=A1=A2=K1=K2=咖啡因C咖=A3=A4=K3=K4=•未知样品浓度计算五、实验结果处理1、计算咖啡因和非那西汀在二者最大吸收波长处的吸光系数k咖λmax咖、k非λmax咖、k咖λmax非和k非λmax非。2、计算未知样中咖啡因和非那西汀的浓度。1）根据吸光度公式列出联立方程组2）解方程组，求出浓度C非那西汀和C咖啡因。3）根据未知样试液的制备方法求出未知样中咖啡因和非那西汀的浓度。3、将咖啡因和非那西汀以及未知样试液的吸收光谱图画在实验报告上。实验注意事项1.仪器使用时要符合仪器工作环境的要求:稳固的工作台，适宜的温度、湿度，避免：日光直射、震动、强电场、强磁场。2.仪器保养和维护方法：用软布稍微蘸取水，轻柔擦拭外表面，避免蘸取过多水而流入仪器内部。清除样品室内残留液体样品，防止蒸发，避免腐蚀样品室。3.每半年进行一次波长准确度检查。4.比色池的使用规则1）手拿部位：毛玻璃面2）用镜头纸擦拭透光面3）用后及时清洗，放入比色池盒内。6.样品池使用挥发性物质时比色皿要加皿盖。7.仪器自检和扫描的过程中，不要打开样品室盖。8.软件不会自动保存数据，所有数据要保存都必须点击“保存”或“另存为”，否则数据会丢失。9.注意人身安全和仪器安全5.使用分光光度计时，要保证样品室绝对干净，小心放入样品，放入比色皿前一定要先用擦镜纸将比色皿外表面擦干净，不要污染样品池和光度计外表面。思考题1、分光光度计由哪几部分组成？各部件的作用是什么？2、什么是吸光度加和原理？3、用解方程组的方法测定两混合物的含量，该体系（混合液）必须具备什么性质？GC实验：外标法标准曲线法测混合物中乙酸乙酯含量指导教师：张晓明在气相色谱分析中，常常在相同的色谱条件下，测定标准样品和未知样品的保留时间（或保留体积），由标准物质的保留时间与未知物质的保留时间进行定性推定，进而确定出未知物资。此即为定性分析。由标准物资浓度推算出未知混合样品中某一物质的浓度即为定量分析实验原理外标法是仪器分析常用的方法之一，是比较法的一种。与内标法相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积(或峰高)与被测组分的色谱峰面积（峰高）进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质，但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。标准曲线法是用已知不同含量的标样系列等量进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线，也就是校正曲线。定量分析样品时，在测校正曲线相同条件下进同等样量的等测样品，从色谱图上测出峰高或峰面积，在从校正曲线查出样品的含量。校正因子求算法时将标样多次分析后得到的响应信号与其含量求出它的绝对校正因子，再根据公式求出待测样品中的含量。本实验采用外标校正曲线法，在与待测样相同条件下测定一系列已知浓度的乙酸乙酯标准溶液，记录其响应值，画标准曲线，然后在曲线上查找到对应的混合待测样中乙酸乙酯的浓度。注：外标法适用于工厂中的常规分析，它用于痕量组分的分析也能得到满意的结果。这个方法的精确度，在很大程度上取决于操作条件的控制。样品分析的操作条件，必须严格控制于绘制校正曲线时的条件。当峰高对操作条件的敏感性以及对拖尾峰、柱子超负荷和检测器有大的响应时，给出非线性的校正曲线，此时峰面积计算常常可以得到更好的结果。不过，对重叠峰，难以准确的测量峰面积，必须提高分离度才能达到预期的效果。对于工厂的常规分析，使用外标法必须经常对校正曲线进行验证。如果曲线外推通过坐标原点，验证时可以只取一个点（进一次标准样品）外标法误差的来源，除了分离条件的变化之外，就是进样的重复性。使用注射器进样，会有一定误差，使用定量进样阀可获得1%的精密度；若同时小心控制分离参数，分析精密度可达±0.25%。思考题1.说明气相色谱仪的组成部件。2.外标法对物质进行定量分析，其方法有哪些优点和缺点？3.色谱定性及定量分析的依据分别是什么？荧光分析法简述指导教师：陈奇丹核黄素易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。核黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测核黄素时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。二、实验原理化学名：7,8-二甲基－10［(2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基］苯并蝶啶-2,4（3H，10H）-二酮分子式：C17H20N4O6分子量：376.36三、实验仪器RF-5301PC荧光光度计日本岛津公司①在实验中，拿比色杯要拿4个棱角，切勿拿光滑的透光面，以免影响检测效果②比色杯用后，应用醇或其它有机溶剂浸泡③氙灯长时间使用（1000h以上）后可能会发生爆炸，所以保证期（500h）以后，应及时更换。④在安装或更换氙灯时，应确认电源开关为OFF，并切断电源。七.使用注意事项八、思考题1.荧光分光光度计与紫外分光光度计的两点主要区别是什么？2.荧光产生的机理？3.荧光分光光度计的比色皿为什么四面透光？4.为什么荧光分光光度计入射光源和检测器的方向是垂直的？5.为什么不能在碱性环境下检测核黄素？高效液相色谱法定量测定水中苯酚类化合物指导教师：赵建军实验原理定量分析：(外标法)在一个合适的色谱条件下测得一个（或者一系列）标准品色谱图并得到其保留时间、峰高和峰面积，再以相同的色谱条件测定未知样品的色谱图，也可以得到保留时间、峰高和峰面积，通过已知浓度标准物质的峰高或积分面积，进而计算出未知样品得浓度，这种分析方法叫做HPLC定量分析方法。•我们采用标准曲线法对对苯二酚进行定量分析。•以不同浓度的对苯二酚其峰面积（或峰高）对该样品的浓度作标准曲线（峰面积为纵坐标、浓度为横坐标），•在标准曲线上查出未知样品中对苯二酚的浓度。（二）、具体步骤1、设定参数表（结束时间10分钟、等浓度洗脱、流速1.2ml/min、检测波长270nm）2、用20%甲醇清洗进样针,3、进样针吸取不同浓度的对苯二酚标准溶液25ul，进样后，测得各浓度溶液的峰高和峰面积。4、进样针吸取未知样品溶液，以同样的方法测得峰高和峰面积。5、以标准物质的峰高或峰面积对浓度作标准曲线6、以未知样品峰高或峰面积在标准曲线上查出其中对苯二酚的浓度。红外光谱定性分析实验二、实验原理傅立叶红外光谱仪利用不同物质具有不同结构而扫描出的相应的特征红外吸收光谱图。它反映了分子中各基团的振动特征。由于振动能级和转动能级不同，能级间的差值也不同，各种物质对红外光的吸收波长也不同。因此，不同结构的化合物的红外光谱具有与其结构特征相对应的特征性。红外光谱谱带的数目、位置、形状和吸收强度均随化合物的结构和所处的状态的不同而不同，因此，利用红外光谱与化合物的官能团或其结构的关系可对有机化合物进行定性分析。2、仪器结构组成：显示器、PC机、样品槽、电源指示灯、干燥指示灯、电源开关三、实验用品4、傅立叶红外光谱仪的基本操作1、打开红外光谱仪的电源开关。2、点击电脑屏幕打开IRsolution工作站软件。3、点击测定，使屏幕转到测定界面。之后初始化仪器。4、制备溴化钾空白片和样品压片。5、将压制好的溴化钾空白片（不含样品的溴化钾空片）放入光谱仪样品室内的样品架上。6、点击测定按钮下的背景按钮，输入光谱名称，确认采集参比背景光谱。7、背景谱图采集完毕后，将待测样品片放入光谱仪内，关上仓盖。8、软件可按要求对谱图进行各种分析处理，从文件菜单中选择打印，将谱图以不同形式打印出报告。9、退出系统。三、实验用品5、仪器使用注意事项1）仪器一定要安装在稳定牢固的实验台上，远离振动源。2）供试品测试完毕后应及时取出，长时间放置在样品室中会污染光学系统，引起性能下降。样品室应保持干燥，应及时更换干燥剂。3)所用的试剂、试样保持干燥，用完后及时放入干燥器中。4)压片模具及液体吸收池等红外附件，使用完后应及时擦拭干净，必要时清洗，保存在干燥器中，以免锈蚀。5)光路中有激光，开机时严禁眼睛进入光路。6)测定完毕，要及时做好仪器使用登记记录。三、实验用品四、实验步骤（一）固体样片的制备1、压模机（压片机）压模由底座、压杆和压舌组成。压舌的直径为13mm，两个压舌