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乳铁蛋白结合聚乙二醇聚乳酸纳米粒脑内递药特性的体内外研究胡凯莉，李靖炜，沈烨虹,陆伟，高小玲,蒋新国*（复旦大学药学院药剂教研室，上海200032）摘要：目的构建一种新型可生物降解脑内递药系统-乳铁蛋白结合聚乙二醇聚乳酸纳米粒（Lf-NP），并对其脑内递药特性进行体内外评价。方法采用马来酰亚胺基聚乙二醇-聚乳酸和甲氧基聚乙二醇-聚乳酸通过复乳溶剂挥发法制备纳米粒（NP）,将其与巯基化的乳铁蛋白（Lf）共价连接制得Lf-NP。采用透射电镜技术，免疫电镜技术，动态光散射分析，X-射线光电子能谱分析及酶联免疫吸附试验对Lf-NP的形态,粒径和表面Lf的连接进行鉴定和表征。以香豆素-6为荧光探针定性及定量的研究了小鼠脑毛细血管内皮细胞bEnd.3对Lf-NP的摄取情况。采用CCK-8评价了Lf-NP对细胞活力的影响。利用荧光显微技术和冷冻切片技术观察小鼠尾静脉注射载香豆素-6的Lf-NP后的脑内分布情况并进行了药动学研究。结果制得的Lf-NP形态圆整，粒径在110nm左右。免疫电镜技术，X-射线光电子能谱分析及酶联免疫吸附试验证实了Lf-NP表面共价连接有Lf，且每个Lf-NP表面的Lf数约为55。bEnd.3对Lf-NP的摄取在37℃，不同浓度和不同孵育时间条件下均显著高于未结合纳米粒（NP）。静脉注射载香豆素-6的纳米粒后，Lf-NP组小鼠脑内香豆素-6的量约为NP组的3倍。3mg/ml的Lf-NP对bEnd.3细胞的活力无显著影响。结论Lf-NP能显著增加药物的脑内递送且具有较好的生物相容性，有望作为一种新型的脑内递送系统输送蛋白多肽和基因等大分子药物入脑。关键词：乳铁蛋白；血脑屏障；香豆素-6；生物可降解纳米粒；脑内递送中图分类号：R9基金项目：国家973项目“导向性纳米载药系统及其脑部疾病治疗与诊断中的应用基础研究”作者简介：胡凯莉，女，博士研究生*通讯作者：蒋新国，男，研究员，博士生导师Tel:(021)54237381E-mail:xgjiang@shmu.edu.cnLactoferrin-conjugatedPEG–PLAnanoparticleswithimprovedbraindelivery:invitroandinvivoevaluationsHUKai-li,LIJing-wei,SHENYe-hong,LUWei,GAOXiao-ling,JiangXin-guo(DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai200032)ABSTRACT：OBJECTIVEToconstructthelactoferrin(Lf)conjugatedpoly(ethyleneglycol)–poly(lactide)(PEG–PLA)nanoparticle(Lf–NP)asanovelbiodegradablebraindrugdeliverysystemandevaluateitsinvitroandinvivodeliveryproperties.METHODSLfwasthiolatedandconjugatedtothedistalmaleimidefunctionssurroundingonthepegylatednanoparticlespreparedbydoubleemulsionandsolventevaporationproceduretoformtheLf–NP.Dynamiclightscatteringanalysis,transmissionelectronmicrograph(TEM),X-rayphotoelectronspectrometryanalysisandELISAwereusedtocharacterizetheLf-NP.Afluorescentprobe,coumarin-6wasincorporatedintoLf–NPanditsuptakebyamousebraincapillaryendothelialcellline,bEnd.3werecomparedtothatofunconjugatednanoparticle(NP).ThebraindistributionofLf-NPfollowinganintravenousadministrationwasevaluatedquantitativelybypharmacokineticstudiesandqualitativelybyfluorescentmicroscopy.TheinfluenceofLf-NPoncellviabilitywasalsoevaluated.RESULTSDynamiclightscatteringanalysisandtransmissionelectronmicrograph(TEM)showedthattheLf–NPhadaroundandregularshapewithanaveragediameterofaround110nm.TheexistenceofLfonthesurfaceofLf–NPwasverifiedbyTEMobservationandX-rayphotoelectronspectrometryanalysis.TheLfELISAresultsconfirmedthebiorecognitiveactivityofLfafterthecovalentcouplingprocedureandsuggestedtheaveragenumberofLfconjugatedoneachnanoparticlewasaround55.TheuptakeofLf–NPbybEnd.3wasshownsignificantlyhigherthanthatofNPat37℃,atdifferentconcentrationsandincubationtimes.Followinganintravenousadministrationofadoseof60mg/kginmicecaudalvein,anear3foldsofcoumarin-6werefoundinthemicebraincarriedbyLf–NPcomparedtothatcarriedbyNP.CellviabilityexperimentresultsconfirmedgoodsafetyofthebiodegradableLf–NP.CONCLUSIONThesignificantinvitroandinvivoresultssuggestedthatLf–NPisapromisingbraindrugdeliverysystemwithlowtoxicity.KEYWORDS:Lactoferrin;Blood–brainbarrier(BBB);Coumarin-6;Biodegradablenanoparticle;Braindelivery血脑屏障（BBB）在保护中枢神经系统免受外源性毒物损伤的同时也限制了大多数神经治疗药物入脑，成为脑部疾病治疗的最大障碍[1]。大约98%的小分子药物和几乎100%的大分子药物，包括酶，基因和siRNAs等均不能透过BBB[2]。随着现今脑部疾病发病率的不断升高，通过各种给药系统和靶向策略增加药物的脑内传递已成为解决这一问题的关键。局部侵入给药（脑内直接注射/滴注）易引发感染，手术费用高且有效递药面积有限[3]。而非侵入给药借助BBB上存在的内源性物质转运系统可以避免破坏血脑屏障并实现广泛的全脑递药[4]。在各种非侵入给药方式中，利用在BBB上存在特异受体的靶向头基连接载药系统得到的受体介导的脑内递药系统在具有脑靶向功能的同时能够提高药物包封率，降低副作用和避免多药耐药系统的外排，具有很好的前景[5]。目前最具代表性的受体介导脑内递药系统OX–26结合的免疫脂质体成功用于小分子药物及基因药物的脑内递送，证实了受体介导途径优良的脑内递药能力[6,7]。然而，脂质体的稳定性差及单克隆抗体效果的不稳定限制了其进一步应用[8-10]。因此，脑部疾病的治疗仍需开发新型的脑内递药系统。乳铁蛋白是一种阳离子铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族，它由690个氨基酸折叠而成两个球形裂片，各包含一个铁结合位点。Lf具有抗炎，免疫调节，抗菌及抗癌等多种生理功能[11]。现已证明多种生物BBB表面均存在Lf受体（LfR），能够介导Lf转运[12-14]。最近,Ji等人比较了Tf，OX-26和Lf的入脑性能，结果证实Lf的入脑能力显著高于前两者[15]。本试验利用Lf的脑靶向能力构建了受体介导的生物可降解脑内递药系统并探索了Lf作为脑靶向头基的能力。采用聚乙二醇-聚乳酸纳米粒与Lf连接是基于纳米粒相对于脂质体的诸多优点：具有较好的稳定性，处方中辅料种类较少，制备相对简单，具有一定的缓释能力便于慢性疾病的治疗[16]。此外，聚乙二醇和聚乳酸都是FDA已批准的辅料，将使载药系统具有较好的生物相容性和安全性[17，18]。为了评价其脑内递药特性，以香豆素-6为荧光探针定性和定量地研究了小鼠脑毛细血管内皮细胞对Lf-NP和NP的摄取及它们在小鼠脑内的分布,并通过细胞活力试验进行了该系统体外毒性的评价。1.仪器和材料JY92-II超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；R-200旋转蒸发仪和B-490恒温水浴（Buchi，德国）；NICOMPTM380ZLS粒度/zeta电位测定仪（NICOMP，美国）；PHI5000CX射线光电子能谱仪（ESCAsystem，美国）；CM120透射电镜（Philip，荷兰）；CO2培养箱（Heraeus，中国香港）；UFX-DX倒置相差显微镜（Nikon，日本）；UFX-II荧光显微镜（Nikon，日本）；LC-10ARF-10AXL高效液相色谱仪（Shimadzu，日本）。乳铁蛋白（Sigma,美国）；MPEG（Mr3000，SUNBRIGHTTMMEH-30H，NOF，日本）；Maleimide-PEG（Mr3400，NEKTAR，美国）；Traut’s试剂（Sigma，美国）；山羊抗Lf抗体（Bethyl，美国）；10nm胶体金标记兔抗山羊IgG抗体（Sigma，美国）；LfELISA试剂盒（Bethyl，美国）；HiTrap脱盐柱（AmershamPharmaciaBiotechAB，瑞典）；DMEM培养液和胎牛血清（Gibco，美国）；荧光封片剂（Dako，美国）；香豆素-6（Aldrich，德国）；CCK-8（DojindoLaboratories，日本）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海申能博彩公司，中国）；昆明鼠（18-20g，♂，复旦大学实验动物部）。2.实验方法2.1NP和Lf-NP的制备及表征马来酰亚胺基聚乙二醇-聚乳酸和甲氧基聚乙二醇-聚乳酸1：9混合以复乳溶剂挥发法制备NP[19]。Lf与Traut’s试剂1：40反应后以HiTrap脱盐柱进行纯化。巯基化Lf与NP常温下反应9h制得Lf-NP。成初乳前有机相中加入香豆素-6，制备载香豆素-6的NP和Lf-NP，以SepharoseCL-4B除去未包封的香豆素-6。采用透射电镜技术（TEM）和动态光散射分析（DLS）对Lf-NP和NP的形态，粒径进行表征。以免疫电镜技术和X-射线光电子能谱对Lf-NP表面连接的Lf进行验证。ELISA测定Lf-NP表面Lf个数。考察载香豆素-6的Lf-NP和NP在pH4.0和pH7.0两种介质中24h的体外释放情况。2.2Lf-NP脑内递药特性和生物相容性的体外评价小鼠脑毛细血管内皮细胞bEnd.3以104/cm2密度接种于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，置于24孔培养板中培养1天。细胞用HBSS预先孵育15min后，分别加入载香豆素-6Lf-NP和NP的HBSS溶液（15μg/ml），37℃分别孵育0.5h、1h和2h。弃去纳米粒溶