56分子生物学常用技术及其应用

第十二章分子生物学常用技术及其应用序言21世纪是生命科学的世纪！生物技术是当今发展最快、最活跃、对社会与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其中基因工程和发酵工程是生物技术的核心。世界各国政府高度重视生物技术我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、新材料等高科技领域的第二位。可见其战略地位。生物技术正在改变人们的生活和观念随着基因组计划的接近完成及后基因组计划的开展，借助计算机处理复杂信息的强大能力，21世纪的生物技术将会有更大发展，有些领域甚至可能有重大突破。第一节自然界的基因转移和重组一、接合二、转化三、转导四、转座质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞获得新的遗传表型病毒把某一细胞的DNA带至另一细胞，使后者获得新的遗传表型DNA片段从染色体的某处移位到另一处。重组的类型：1.位点特异性重组(site-specificrecombination)2.同源重组（homologousrecombination）四、基因重组(recombinant)不同DNA分子间发生的共价连接同源区AaBbBAabBAbaBaAbBb机制1.同源重组（homologousrecombination）aA功能1.在减数分裂过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个（群）体的多样性。2.是DNA损伤修复的重要机制之一。2.位点特异性的基因重组由整合酶催化，重组仅在特定的基因片段和位点上进行。是免疫球蛋白多样性的分子机制。第二节基因工程的工具——工具酶和载体一、常用的工具酶(一)限制性内切酶(restrictionendonuclease)---切——基因工程的手术刀功能：识别双链DNA中特异序列，该序列的特征为4-6个核苷酸的回文结构，并在识别序列内或附近特异切割DNA，产生粘性末端或平末端。根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子没有限制性内切酶的发现和应用，就很难有今天分子生物学与基因工程的快速发展。作用模式图：1.产生5′突出粘性末端(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′POH—作用模式图：2.产生3′突出粘性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********作用模式图：3.产生平末端(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′OH——PCT*************GA*************限制性内切酶用途：1.基因重组过程中切割DNA以获取目的基因片段，切割载体形成切口，使目的基因能插入载体中。2.限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphysms,RFLP)分析：遗传病的诊断，法医DNA指纹分析等。3.构建DNA的物理图谱，基因定位，DNA的同源性分析等等。(二)DNA连接酶(DNAligase)——基因工程的缝纫针将两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组。功能：催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5′磷酸基团与3′羟基形成磷酸酯键。也可将双链DNA分子内部的单个切口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用于RNA，但效率很低。如需连接单链DNA或RNA，则需用RNA连接酶。DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末端效率低得多。DNA连接酶EcoRI**********GAATTC********************CTTAAG**********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—POH—DNA连接酶作用模式图：1.连接粘性末端作用模式图：2.连接平末端AluI*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′OH——PCT*************GA*************DNA连接酶(三)反转录酶(ReverseTranscriptase)功能：以RNA为模板，以带3′-OH末端的DNA片段为引物，沿5′至3′方向合成DNA链。3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′dNTPMg2+反转录酶3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′5′TTTTTTT—OH3′AGACAGGAT……3′1.RNA指导的DNA聚合酶活性：5′TTTTTTT2.DNA指导的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H活性；DNA解旋酶活性等。用途：1.反转录酶的最主要作用是以mRNA为模板合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)。2.以单链DNA或RNA为模板制备探针。功能：(四)核酸酶S1功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。核酸酶S1核酸酶S1+核酸酶S1(四)核酸酶S1用途：1.除去双链DNA的粘性末端以产生平末端；2.除去cDNA合成时形成的发夹结构；3.分析RNA的茎环结构以及DNA-RNA分子的杂交情况等。功能：催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。1.底物是单链DNA或有3′突出末端的双链DNA。OH5′3′Mg2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi5′3′OHMg2+dNTPnppi5′3′(A、G、C、T)n2.底物是平端或3′凹端的双链DNA。5′3′Co2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi5′3′Co2+dNTPnppi5′3′OHOH(A、G、C、T)n用途：1.主要作用是在载体或目的基因3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。2.DNA3′末端的同位素标记。(六)核糖核酸酶H水解DNA-RNA杂交分子中的RNA链。RNADNA核糖核酸酶HDNA用途：功能：用核糖核酸酶H部分水解mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，使未被水解的mRNA作为引物合成cDNA的第二链。二、载体(vector)目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。作为基因工程载体所需具备的基本条件：1.能自我复制，并具一定的拷贝数。2.带有抗性基因，便于筛选和鉴定。4.带有强启动子，驱动目的基因在宿主细胞内高效表达。3.在适当的位置有单酶切位点，便于重组操作。1.细菌质粒：最常用的用于目的基因克隆或表达的载体。2.噬菌体：主要用于构建基因组DNA或cDNA文库。3.M13噬菌体：专用于Sanger双脱氧DNA测序4.粘粒：用于克隆大片段DNA。5.酵母质粒：用于在酵母中表达目的蛋白。6.病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫病毒及植物病毒。用于在真核细胞中表达目的蛋白。基因工程载体的种类和用途：(一)质粒(plasmid)细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义:细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构：Ampr,Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。PstI,BamHI：两个单酶切位点用于插入目的基因AmprLacZMCSpfxBlue:克隆质粒MCS：MultipleClonningSite提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ:蓝白斑筛选阳性克隆P(LacZ)MCSAmprLacZpRS426：原核细胞表达质粒P(LacZ)：LacZ启动子用于在原核细胞驱动目的基因的表达。pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子驱动目的基因在真核细胞内表达BGHpA：加尾信号目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。(二)噬菌体(phage)1.噬菌体(phage)2.粘粒(cosmid)3.M13噬菌体1.噬菌体AWBDEFZJattxisNclcroOPQSR结构区重组区调控区裂解区cos位点cos位点ARAREcoRI目的基因插入型置换型筛选标记：蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。(1)重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体分子量大小的75%至105%之间。用途：b.用于构建基因组或cDNA文库。c.用于抗体库或随机肽库的构建。a.用作一般的克隆载体。2.粘粒(cosmid)组成：2.抗性基因；1.质粒复制的起始位点(ORI)；3.用于插入目的基因的单个酶切位点；4.噬菌体的cos位点。可见，cosmid是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。特点：1.可插入长达27～41kb的外源基因，方便地用于克隆大片段DNA。2.加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌。3.粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。3.M13噬菌体噬菌体正链复制复制型DNA经pII蛋白造缺口3′5′经pII蛋白剪切释出单链DNA(正链)进入下一循环5′3′3′5′滚环复制在细菌内的复制模式图M13噬菌体几个重要特点：1.M13噬菌体不溶解宿主细胞，只是降低宿主细胞的生长速度。2.M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。3.克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。M13噬菌体用途：1.DNA序列测定；2.制备单链DNA探针；3.用于定点突变的研究。第三节基因工程的步骤基因工程的基本步骤1.基因工程的上游技术：基因重组++连接转化、筛选和鉴定阳性克隆含重组子的阳性克隆载体目的基因分、切、接、转、筛2.基因工程的下游技术：(1)发酵工程(2)蛋白质的分离、纯化与质量鉴定发酵条件(生物反应器结构、细菌培养温度、空气通量、pH及培养基成分等)的优化组合。基因工程的基本步骤一、目的基因的制备—分(一)人工合成法(也即化学合成法)本方法适用于分子量较小的目的基因(100bp以内)。缺点：2.如目的基因DNA序列需通过氨基酸序列推测，难于保证与天然基因序列一致，往往导致表达效率大大降低。1.只能合成较小片段的DNA(100bp以内)。(二)反转录法本法是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。(二)反转录法：方案：AAnATTnT5′5′mRNA反转录酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA3′5′3′5′5′加热变性加入特异性引物DNA聚合酶重复上述步骤扩增出大量的产物聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)(三)直接从染色体DNA中分离本方法较适用于制备原核生物目的基因，其原因为：1.真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，在原核细胞中转录后不能剪接。2.真核细胞的基因多数为单拷贝，难于分离到足够的目的基因。根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用合适的限制性内切酶切割染色体DNA，分离目的基因。(四)从基因文库(genelibrary)中获取基因组文库：G-文库cDNA文库：c-文库(常用)方法：基因文库用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。(一)粘性末端连接用同一种或