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本科毕业论文题目不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响学院动物科学技术学院专业水产养殖学毕业届别2011届姓名张力涛指导教师蔡原职称副教授甘肃农业大学教务处制二〇一一年六月张力涛：不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响1目录题目……………………………………………………………………2摘要……………………………………………………………………21文献综述………………………………………………………………21.1甘肃省虹鳟鱼种质资源………………………………………21.2国内外虹鳟鱼分子水平研究进展……………………………21.3研究目的及意义……………………………………………………32材料与方法……………………………………………………………32.1实验材料……………………………………………………………32.1.1实验样品…………………………………………………………32.1.2主要仪器…………………………………………………………32.1.2主要试剂………………………………………………………42.1.4溶液配制………………………………………………………42.2基因组DNA提取方法………………………………………………52.3基因组DNA检测……………………………………………………62.3.1琼脂糖凝胶电泳检测…………………………………………62.3.2DNA纯度及浓度测定…………………………………………63结果与分析…………………………………………………………63.1琼脂糖凝胶电泳检测结果………………………………………63.2ND-1000型分光光度计检测结果…………………………………74讨论……………………………………………………………………95结果…………………………………………………………………10参考文献………………………………………………………………11摘要…………………………………………………………………13致谢…………………………………………………………………14张力涛：不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响2不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响张力涛（甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州730070）摘要为虹鳟鱼遗传特征研究奠定基因组DNA提取的实验基础，本研究以虹鳟鱼肌肉组织为材料,按照常规的酚-氯仿抽提法和另外设计的一种不同方法进行基因组DNA提取并比较其效果。结果表明,采用常规酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA受蛋白质污染小；而另一种未加蛋白酶K的DNA提取法由于蛋白质未被消化降解且抽提次数较少，虽提取的DNA浓度较高但蛋白质残留较为严重，这对于PCR扩增的影响较大。因此，使用蛋白酶K的常规酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA适于PCR扩增等后续实验研究。关键词鳟鱼；基因组DNA；提取；效果；比较1文献综述1.1甘肃省虹鳟鱼种质资源虹鳟(Oncorhynchusmykiss)属鲱形目、鲑科,是我国淡水养殖的主要经济鱼类。原产于美国加利福尼亚,1874年经人工迁徙驯化已在世界各地进行养殖,1959年从朝鲜移入我国黑龙江省,目前国内已有20多个省(市)开展了虹鳟养殖。甘肃是国内引进虹鳟试养(1977年)较早的省份之一，在20世纪90年代初以冷水性鱼类虹鳟的突变体为材料选育成了甘肃金鳟新品系，2007年4月被农业部列为适宜在全国具冷水资源的地区养殖的优良品种。其与目前国内外养殖的道氏虹鳟、日本金鳟相比，甘肃金鳟(Oncorhynchusmykissaguabonita)体色更艳丽，且性情温顺、生长速度快、抗病力强、个体大、耐低氧、肉质细嫩，具有很高的观赏价值和食用价值等特点，深受渔业生产者和消费者的青睐，在国内具有很强的市场竞争能力。1.2国内外虹鳟鱼分子水平研究进展随着分子生物学的快速发展，国内外对虹鳟在分子水平上也展开了多方面的研究工作。在Young等(1998)就建立了虹鳟二倍体的遗传连锁图谱[1],而后Sakamoto等(2000)又建立了微卫星相关的精细连锁图谱[2]。功能基因研究方面，虹鳟生长激素基因的cDNA于1986年被克隆并在大肠杆菌中表达[3]，随后虹鳟生长激素基因的二种结构类型又被发现[4]。近年来，虹鳟生长激素基因的内含子与激素调节、垂体表达关系等也有研究报道[5,6]；同时，张力涛：不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响3利用基因型频率计算雌雄间遗传差异和亲子鉴别技术进行虹鳟鱼亲本的选择已有初步研究成果[7]。在鳟鱼的遗传多样性及遗传资源研究方面，Robert(2003)和Riho等(2007)在分子水平上对虹鳟的遗传多样性及其遗传资源评价开展了卓有成效的研究[8]。在国内，张艳萍等(2008)采用RAPD技术,对甘肃金鳟的人工繁殖群体进行了遗传多样性研究,并和日本金鳟、道氏虹鳟的遗传结构进行了比较[9，10]。赵莹莹等（2006）利用微卫星标记对黑龙江水产研究所的6个虹鳟养殖群体进行了研究[11]，于冬梅等（2008）对黑龙江引进的虹鳟养殖群体遗传结构进行了研究[12]。目前在分子水平上开展遗传多样性和遗传资源评价的技术相当成熟，并在许多动植物研究中取得了显著成果。鳟鱼作为具有极高食用和观赏价值之一的物种，在分子水平上的研究相对较少，尤其是对甘肃金鳟和虹鳟鱼遗传资源的系统研究很少有报道，因此对其展开相关研究具有重要意义。1.3研究目的及意义随着分子生物学研究的迅速发展,基因组DNA（genomicDNA，gDNA）的提取已成为一项常规实验,是分子遗传学实验中最常用的基本操作之一,也是最关键的一步。尽管有关提取DNA方法的报道很多,但针对不同的生物材料,一些细微的差别会影响DNA提取的效果，进而影响后续研究，如PCR扩增、限制性内切酶的酶切反应以及分子克隆、测序等实验环节。因此，根据具体研究材料，选择简便、快速、优质高效的基因组DNA提取方法尤为重要。为了获得较高质量的鳟鱼基因组DNA，为遗传多样性研究和遗传资源评价等奠定基础，本研究以常规酚-氯仿抽提法为基础，在个别步骤上设计不同处理进行甘肃鳟鱼基因组DNA提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度计进行提取效果检测，比较不同处理的基因组DNA提取效果。2材料与方法2.1实验材料2.1.1试验样品本研究以虹鳟鱼肌肉组织为材料，来自甘肃省刘家峡养殖场。2.1.2主要仪器MILLIQ超纯水系统、TGL-16B型冷冻高速离心机、HH-S4型数显恒温水浴锅、电子天平、移液枪、DYY-6C型电泳仪、DYY-III型水平电泳槽、SIM-F124制冰机、YXQ-LS-30SII型立式压力蒸汽灭菌器、微波炉、凝胶成像分析系统（法国，Vilberlourmat）、超低温冰箱、张力涛：不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响4ND-1000NanoDropSpectrophotometerv3.3DNA（NanoDropTechnologies,Inc）。2.1.3主要试剂Tris碱（三羟甲基氨基甲烷)、SDS（十二烷基硫酸钠）、EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、琼脂糖、蛋白酶K。无水乙醇、硼酸、氢氧化钠、冰乙酸、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、盐酸、醋酸钠均为国产分析纯。2.1.4溶液配制(1)1MTris.HCl(pH8.0):称取60.57gTris溶于400m1双蒸水中，加浓盐酸调pH至8.0，定容至500m1，高压灭菌，4℃保存。(2)0.5MEDTA(pH8.0):称取18.61g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA.2H2O)溶于50m1双蒸水中，调节pH至8.0，定容至100m1，高压灭菌，4℃保存。(3)10%SDS:10gSDS溶于90m1水中，加热至68℃助溶，用HCI调pH值至7.2，定容至100mL。(4)2MNaCI:称取58.44gNaCI溶于500m1超纯水中，高压灭菌.(5)组织样解液：1MTris.HCl(pH8.0)25ml，0.5MEDTA100mL、2MNaCI25ml，10%SDS50ml，加超纯水定容至500mL。(6)蛋白酶K（20）mg/ml:100mg蛋白酶K溶于5ml灭菌双蒸水，1mL管EP管分装，-20℃保存。(7)TE缓冲液(pH8.0):1MTris-HCI(pH8.0)5mL、0.5MEDTA(pH8.0)1mL，加超纯水定容至500mL，高压灭菌。(8)3MNaAc(pH5.2):称取12.305g无水NaAc加双蒸水溶解，定容至50m1,加冰乙酸调节pH至5.2，高压灭菌。(9)氯仿/异戊醇（24:1):将氯仿、异戊醇按24:1体积充分混合后装入棕色瓶中，4℃保存。(10)饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）:将饱和酚、氯仿、异戊醇按25;24:1体积充分混合后装入棕色瓶中，4℃保存。(11)5×TBE缓冲液:称取Tris碱54g,硼酸27.5g，加入20mL0.5MEDTA（pH8.0），加蒸馏水溶解，定容至1000mL，室温保存。(12)1×TBE:将5×TBE与蒸馏水按1:4混合。(13)1.0%的琼脂糖:1.0g琼脂糖充分溶解于100m11×TBE缓冲液中。张力涛：不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响52.2基因组DNA的提取方法2.2.1采用常规酚-氯仿抽提法，参考《分子克隆试验指南》[13]。（1）将鱼肉组织剪碎，取大约0.03g～0.05g装入1.5ml高压灭菌离心管中（注：每一样品剪完所用镊子、手术剪刀用酒精棉球擦干净，除去残留的组织；酒精挥发干净）；（2）向各个EP管中加入600μL组织裂解液，用封口膜封口后放入55℃恒温水浴箱中温浴3-4h；（3）加入ProK（20mg/ml）溶液10μL，封口后55℃水浴锅消化12h（过夜，直到组织全部被消化）；（4）将样品从水浴锅中取出，待冷却至室温后加入等体积约600μL的Tris饱和酚，将样品插入泡沫板后缓慢颠倒摇晃10min，使溶液的两相充分混匀，然后放入离心机在4℃12000rpm下离心10min；（5）用剪好的蓝枪头吸取上清到另一1.5mlEP管中（用剪刀将1mL蓝枪头剪成直径大于3mm；吸取上清液时不要把上层那层乳白色的蛋白质吸上来，不要吸出两相界面）；（6）往上清液中加入600μLTris饱和酚，摇动混匀10min，在4℃12000rpm下离心10min；（7）吸取上层清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混匀10min（300μL酚、300μL氯仿：异戊醇），在4℃12000rpm下离心10min；（8）取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）600μL，混匀10min，在4℃12000rpm下离心10min；（9）取上清液加入60μL的3mol/LNaAc和-20℃充分预冷无水乙醇1000μL，盖上盖子轻摇即出现乳白色丝状DNA沉淀浮与液体中。将样品置于冰中15min，取出4℃12000rpm下离心10min，使DNA沉于管底部；（10）弃上清，加75％乙醇1000μL，混匀漂洗以除残留的盐；（11）4℃，12000rpm离心2min，弃上清，加75％乙醇1000μL混匀漂洗DNA；（12）4℃，12000rpm离心2min，小心倒掉乙醇，将离心管倒扣与滤纸上，置于室温下干燥；（13）待乙醇完全挥发，加入200μLTE溶解DNA，放入-20℃冰箱中保存。2.2.2对比方法的DNA提取方法（1）将鱼肉组织剪碎，取大约0.03g～0.05g装入1.5ml高压灭菌离心管中；（2）向各个EP管中加入300μL预冷TE（防止组织块凝固，尽可能制成细胞悬液），3000rpm离心5min；张力涛：不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响6（3）弃上清，加入1000μL组织裂解液，置于55℃水浴锅消化（约3h）至澄清；（4）取上清液，往上清液中加入300μL和300μL氯仿抽提，缓慢摇动充分混合10min，13000rpm，离心10min；（5）取上清液于另一EP管中，加入600μL氯仿抽提，充分混合10min，13000rpm，离心10min；（6）取上清液于另一EP管中，加入1000μL无水乙醇沉淀DNA（轻